细菌DNA提取方法

细菌DNA提取方法细菌dna提取方案细菌DNA提取方案细菌DNA提取方案：革兰氏阴性菌，如E.coli，一般有三种可以选择的方法。一、水煮模板法——主要用于PCR反应1、接种单菌落于LB或脑心平板，连续画线，37摄氏度培养18－24小时。2、刮取1～2接种环菌苔加入150微升三蒸水中，混匀，100摄氏度煮沸10分钟。3、12000转/分钟离心10分钟，取上清，－20摄氏度保存备用。操作最简便，对试剂条件要求低。缺点是纯度不够高，可能会含有RNA、蛋白等杂质。但是作为一般检测目的的PCR反应模板已经足够了。有人称扩增4kb以下片段都可用此种方法制取模版，编者用此类模板PCR可以扩增到3500bp的片段。编者建议：此法得到的模版保存时间短，强烈建议每月重新制作一次。二、CTAB/NaCl法1、接种一单菌落于5mlLB中,30℃培养过夜,2、取1ml种子培养液接入100ml2%LB中,37℃、220r/min培养16小时;3、5000r/min离心10分钟,弃去上清。4、加入10mlTE离心洗涤后,用10mlTE溶解菌体,混匀,-20℃保存备用。5、取3.5ml菌悬液,加入184μl10%SDS,混匀,加入37μl10mg/ml蛋白酶K,混匀,37℃温育1小时6、加入740μl5mol/LNaCl,再加入512μlCTAB/NaCl,混匀,65℃温育10分钟。7、加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。8、上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。9、加入0.6倍的异丙醇,混匀,10000r/min离心5分钟,收集DNA沉淀,用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀。10、用1mlTE溶解DNA,加入终浓度为20μg/mlRNaseA,4℃保存。CTAB/NaCl法提取的DNA纯度较高，蛋白杂质较少，保存时间长，编者更喜欢把终浓度为20μg/mlRnaseA加在第5步温育的时候，这样最后没有RnaseA污染。每一步操作细致一些，得到的DNA可用于Southernblot。编者建议：长时间保存DNA可放于-20℃，但要尽量减少反复冻融，否则影响DNA质量。细菌dna提取方案三、盐析法1、1.5ml对数期菌液2、12000rpm30s3、200ul裂解液（同CTAB/NaCl法），37c,1hr4、66ul5MNaCL,混匀充分，12000rpm10min5、上清用粗枪头取至新管6、等体积酚充分混匀，12000rpm3min，反复抽提至无蛋白层7、取水层，等体积氯仿混匀，12000rpm3min8、上清至新管，2倍体积预冷无水乙醇9、-20C，20min，14000rpm，15min10、400ul70%冷乙醇洗涤11、干燥，100ul20ug/mlRNaseA，37C，30min12、2倍体积无水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗涤13、干燥，溶于100ulTE介于方法一和方法二之间，CTAB虽然取出糖分效果较好，但CTAB本身也是有毒的，所以此方法放弃了CTAB。革兰氏阳性菌，由于细胞壁的结构与阴性菌有差别，裂解比阴性菌稍微麻烦一些，可以采取CTAB/NaCl法稍加修改，在第四步加入终浓度2mg/ml的溶菌酶，37度温育1h。实验注意：提基因组最好要将枪头尖剪掉（剪掉以后在酒精灯上迅速过一下，使其断口圆滑）。以免枪头损伤基因组！抽干时最好是风干！细菌基因组DNA的提取方法综述，提供了5种方法。1快速微量提取法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min,丢去上清夜，收集菌体。B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。2蛋白酶/SDS法制备细菌dna提取方案先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftiasp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用WashingTE（50mmol/LTris-HClpH8.0,10mmol/LEDTApH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml5mg/L的蛋白酶、0.5ml10%SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。31)细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。2)细菌收集：取1ml培养物于1.5mlEP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1mlTE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。3)菌体裂解：加入6μl50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS110μl，20mg/ml的蛋白酶K3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）4)抽提：菌液均分到两个1.5mlEP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）5)沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。12000rpm离心10min。6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。7)抽（凉）干后，溶于50μlddH2O中，取2-5μl电泳。作PCR模板用。4.DNAEXTRACTIONPROCEDURE-GENERAL1)Growcellsovernightin500mlbrothmedium.2)Pelletcellsbycentrifugation,andresuspendin5ml50mMTris(pH8.0),50mMEDTA.3)Freezecellsuspensionat-20C4)Add0.5ml250mMTris(pH8.0),10mg/mllysozymetofrozensuspension,andletthawatroomtemperature.Whenthawed,placeonicefor45min.5)Add1ml0.5%SDS,50mMTris(pH7.5),0.4MEDTA,1mg/mlproteinaseK.Placein50Cwaterbathfor60min.6)Extractwith6mlTris-equilibratedphenolandcentrifugeat10,000Xgfor15min.Transfertoplayertonewtube(avoidinterface).Re-dothisstepifnecessary.7)Add0.1vol3MNaacetate(mixgently),thenadd2vol95%ethanol(mixbyinverting).SpooloutDNAandtransferto5ml50mMTris(pH7.5),1mMEDTA,200g/mlRNase.Dissolveovernightbyrockingat4C.8)Extractwithequalvolumechloroform(mixbyinverting)andcentrifugeat10,000Xgfor5min.Transfertoplayertoanewtube.9)Add0.1vol3MNaacetate(mixgently),thenadd2vol95%ethanol(mixbyinverting).10)SpooloutDNAanddissolvein2ml50mMTris(pH7.5),1mMEDTA.11)CheckpurityofDNAbyelectrophoresisandspectrophotometricanalysis.51)100ml细菌过夜培养液,5000rpm离心10分钟,去上清液。2)加9.5mlTE悬浮沉淀,并加0.5ml10%SDS,50μl20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶K,混匀,37℃保温1小时。3)加1.5ml5mol/LNaCl,混匀。4)加1.5mlCTAB/NaCl溶液,混匀,65℃保温20分钟。5)用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,5000rpm离心10分钟,将上清液移至干净离心管。6)用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提,取上清液移至干净管中。7)加1倍体积异丙醇,颠倒混合,室温下静止10分钟，沉淀DNA。8)用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗后,吸干,溶解于1mlTE,-20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心,使DNA沉淀。9)如要除去其中的RNA,可以按本章第三节中操作步骤处理。注：1)CTAB/NaCl溶液：4.1gNaCl溶解于80mlH2O,缓慢加入10gCTAB,加水至100ml。2)氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70%乙醇，TE，10%SDS，蛋白酶K(20mg/ml或粉剂)，5mol/LNaCl。本方法通过SDS裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分一：仪器：同方法一二：试剂：TE、TAE缓冲液；10%SDS；５ＭNaCL；20mg/ml蛋白酶Ｋ；CTAB/NaCL溶液(10%CTAB，0.7MNaCL4.1gNaCL溶于80ml水中，缓慢加入10gCTAB，加热溶解)；25/24/1,酚/氯仿/异戊醇;24/1,氯仿/异戊醇；异丙醇；７０％及100%乙醇三：操作1.5ml对数生长期细菌细胞离心，5000rpm,1min沉淀溶于500μlTE缓冲液中混匀30μl10%SDS,3μL蛋白酶Ｋ，混匀，37℃,1小时100μlNaCL(5M)混匀80μl的CTAB/NaCL,*混匀；65℃10min（可不做）加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心12000rpm,4-5min取上清，以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA、复溶等步骤一致。注意１，*此步操作后，离心管中NaCL的浓度不应低于0.5M，否则DNA将与CTAB共沉淀。2,本法适用于从多糖含量高的样品中提取DNA。对于菌体样品,通过此流程,?可以获得较为完整的DNA分子。