PCR质量控制

上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory临床基因扩增检验质量控制上海市临床检验中心肖艳群上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory《医疗机构临床实验室管理办法》（卫医发[2006]73号）《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医政发[2010]194号）医学实验室质量和能力认可准则ISO15189(CNAS-CL02)医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的指南（CNAS-GL26）上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory实验室设置要求四个区域（试剂准备区、标本制备区、扩增区、产物分析区）必须是互相独立的各区间不能直通，应有缓冲间应有充分合理的空间、良好的照明、通风和空调设备(不能使用中央空调)标本制备区有生物安全柜、冲眼器除移动紫外灯外，各工作区域内应有固定于房顶的紫外灯传递窗上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory实验室管理进入和使用实验室各区域应有明确的限制和控制，防止患者和其他非相关人员的随意进出不同工作区域内的设备、物品不得混用上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory临床基因扩增检验质量控制分析前—患者准备、标本（采集、运送、验收、保存）、医生报告单申请分析中—样本分样、仪器、核酸提取、核酸扩增、产物分析、检测的有效性判断分析后—试验报告、报告传递、结果的接收、结果的审核、结果解释上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory标本标本采集时间对扩增检测结果的影响标本的类型和采集量采样及运输容器采样质量的评价标本采集中的防污染上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory标本采集时间1、血清（浆）：无特殊要求2、如用泌尿生殖道分泌物做CT、NG项目：应在抗生素应用前或停药两周后采集标本，如不能停用抗生素，应于下次抗生素应用前采集。3、如用痰做TB：应在抗结核药物应用前或停药两周后采集标本，如不能停用抗结核药物，应于下次抗结核药物应用前采集。因为PCR方法所检测的靶物质为核酸，不受标本生物活性的限制，对于已经死亡的病原体仍可检测出来，即感染后在药物治疗有效的情况下，患处仍会有少量已死亡的病原体存在。上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory标本采集量标本的类型和采集量应根据所测病原体而定。一般来说，如果样本的量对病原体培养够用的话，则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增检测。上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory采样容器采样所用的抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。如全血、骨髓和血浆标本，用EDTA抗凝，不使用肝素，因其是Taq酶的强抑制剂，且在核酸提取过程中很难完全去除。使用玻璃器皿，必须为密闭的、必须经高压灭菌，以使可能存在的RNase永久性失活。上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory标本验收、拒收血液标本：溶血、严重脂血等应拒收泌尿生殖道分泌物：镜下观察到上皮细胞存在。痰液：镜下观察上皮细胞很少，一般10个，白细胞一般25个。上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory标本运送实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床标本的运送条件（温度、时间）作出相应规定。靶核酸为DNA的标本，如在无菌条件下，则可以在室温下运送，建议采集后8h之内送至实验室；靶核酸为RNA的标本，如在无菌条件下，可在室温下运送，如为较长时间，则应在加冰条件下运送，建议采集后4h之内送至实验室；所有标本采集后送至实验室之前，所有临床标本在采集后送至实验室前，均应放2－8℃临时保存。淋病奈瑟菌有自溶的特性，标本采集后应立即送检。上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory标本保存靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此标本的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要（避免反复冻融）靶核酸为DNA的标本2-8℃保存1-3天，靶核酸为RNA的标本应－20℃下保存－20℃下保存1个月－70℃以下可长期保存如为提取核酸后用于DNA扩增分析的样本，可于10TE缓冲液{mmol/LTris,1mmol/LEDTA(pH7.5～8.0)}2-8℃下保存。用于RNA扩增分析的样本，则应于上述TE缓冲液中-70℃保存。上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory标本接收标本接收建议在三个测定区之外接收的标本应收集在原始容器中，不能接受从其他检测如生化、免疫检验等分出来的标本，因其有较大的发生标本间污染的可能性上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory标本处理血清（浆）：应1小时内分离血清，抗凝后4小时内分离血浆，然后转移至1.5ml灭菌离心管中保存。若血清分离不充分，可1500rpm离心5min。如甘油三酯含量超过6mmol/L或肉眼可见血清/血浆呈白色浑浊状的标本，应4℃13000rpm离心15min,吸取下层清亮血清或血浆转移至1.5ml灭菌离心管中保存泌尿生殖道分泌物一次性采样管（含保养液）配套棉拭子（不含保养液）痰液结核分枝杆菌DNA检测标本：用4%NaOH摇匀，室温下放置30分钟左右液化，转移至1.5ml灭菌离心管，离心，去上清，留沉淀用于核酸提取。需注意的是液化时不能加热，液化时间不能过长。非结核分枝杆菌DNA检测标本：痰标本在室温悬浮于灭菌生理盐水中，充分震荡混匀，促使大块黏状物下沉，取上清离心，去上清，留沉淀用于核酸提取。切记不能用NaOH液化痰标本。上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory实验室仪器设备分册建立仪器档案定期维护保养定期校准或检定（校准周期、校准单位、校准参数、合格的校准报告）上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory需校准的仪器冰箱温度、温湿度计、移液器、恒温金属浴、生物安全柜、高速冷冻离心机、扩增仪、杂交仪上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory扩增仪结构：温度控制及导热系统、光路系统、检测系统维护：75%乙醇定期清洁热盖和反应槽或孔用无水乙醇清洁光路部分校准：校准周期：定期校准、仪器搬动校准参数：光路部分、背景荧光、温控部分（温度准确度、均一性、温度升降速率）上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory恒温金属浴维护：75%乙醇擦拭加热孔校准：温度准确度（应涵盖试验过程中所涉及的温度）孔间温度的均一性（自校应规定测定孔的选择、测量时间、各孔温度偏差允许范围）上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory移液器维护：75%乙醇擦拭校准：校准周期、外校（厂家、计量所）、校准量程内部校准-参照《定量、可调移液器试行检定规程》(JJG646-90)，注意环境的要求、校准点涵盖试验过程中所涉及的量程上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory生物安全柜清洁:75%乙醇擦拭,不得用次氯酸钠溶液清洁检定：有资质的第三方检测机构检定参数：高效过滤器完整性、流入气流流速、下降气流流速、气流模式上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory高速冷冻离心机维护保养：75%乙醇擦拭校准：转速、温度上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory耗材、试剂耗材带滤芯吸头、离心管爆管和抑制物质检试剂盒的质检包括外观质检和性能质检选择或更换试剂品牌：试剂性能评估更换试剂批号：评价核酸提取效率和扩增效率上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory更换试剂批号质检设置空白对照、阴性对照、低值阳性对照试剂不合格1)低值阳性对照和标准品均未检出，或低值阳性对照未检出而标准品检出率大幅下降，表示试剂失效或检测灵敏度大幅下降。2)低值阳性对照未检出，标准品检测正常，提示样品提取液存在问题。重复新旧提取液阳性对照实验，确定提取液失效问题。3)阴性对照有扩增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。4)低值阳性对照检出，标准品未检出或扩增曲线明显系统性CT值偏大5个循环以上，提示阳性标准品存在问题。试剂合格阴性对照无扩增、低值阳性质控品检出上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory室内质量控制目的监测和控制实验室常规工作的精密度，即实验室测定的批内和批间重复性IQC结果决定了实验室即时测定结果的可靠性和有效性上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory质控品来源及使用来源:第三方、试剂盒自带、自备使用:1)冻干质控品复溶时，要确保所用溶剂的质量；当溶剂为焦碳酸二乙酯（DEPC）水时，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。因DEPC是一种潜在的致癌物质.它可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制物。2)冻干质控品复溶时，所加溶剂的量要准确3)冻干质控品复溶时应轻轻摇匀，切忌剧烈振摇上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory质控品设置、数量定性检测已知弱阳性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，监测核酸提取和扩增检测的有效性已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，判断核酸提取过程中是否发生污染(实验室的以前扩增产物的污染、标本间的交叉污染、强阳性标本气溶胶经加样器导致污染、强阳性标本经操作者手导致污染翻盖离心管在较高温度温育时盖子崩开、扩增反应试剂的污染定量检测已知高、中、低质控品（基质与待测标本相同）已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory板上杂交和膜上斑点印迹杂交的质控：在板上杂交和斑点杂交时，阳性和阴性质控应该在同一板或膜上与病人标本平行进行分析，这可排除不同反应中因使用不同杂交条件所致的对结果的错误解释。上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory质控品位置室内质控品在扩增仪中的排列顺序：不宜固定位置,尽可能监测每一个孔扩增有效性板上杂交和膜上斑点印迹杂交的质控：在板上杂交和斑点杂交时，阳性和阴性质控应该在同一板或膜上与病人标本平行进行分析，这可排除不同反应中因使用不同杂交条件所致的对结果的错误解释。上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory质控品均值建立暂定均值的建立：20d内得到20个数值，或至少在5d内，每天作不少于4次重复检测获得20个数值。对数据进行离群值检验（剔除超过3s外的数据），计算出均值，作为暂定均值。若使用定值质控品，均值必须在实验室内使用自己现行的测定方法进行确定，质控品说明书上的原有标定值只能作参考。常规均值的建立：以最初20个数据和三至五个月在控数据汇集的所有数据计算的累积平均数作为质控品有效期内的常规均值，并以此作为以后室内质控图的均值。上海市临床检验中心ShanghaiCentreforClinicalLaboratory常用质控规则的符号及定义符号定义12S一个质控测定值超出±2s控制限。13S一个质控测定值超出±3s控制限。22S两个连续的质控测定值同时超出+2s或－2s控制限。R4S同一批测定中，两个不同浓度质控物的