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SOD氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。（三）试剂1.0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）；2.130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4.100μmol/LEDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5.20μmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。三、实验步骤1.酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。2.显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液1.5130mmol/LMet溶液0.313mmol/L750μmol/LNBT溶液0.375μmol/L100μmol/LEDTA－Na2液0.310μmol/L20μmol/L核黄素0.320μmol/L酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。3.SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt)上式中，SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重。超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定【实验原理】SOD是含金属辅基的酶，它催化以下反应：02-+02-+2H+H202+02由于超氧阴离子自由基02-寿命短，不稳定，不易直接测定SOD活性,而采用间接的方法。目前常用的方法有3种,包括氮蓝四唑(NBT)光化还原法，邻苯三酚自氧化法，化学发光法。本实验主要介绍光化还原法，其原理是：氮蓝四唑在蛋氨酸和核黄素存在条件下，照光后发生光化还原反应而生成蓝色甲腙，蓝色甲腙在560nm处有最大光吸收.。SOD能抑制NBT的光化还原，其抑制强度与酶活性在一定范围内成正比。试剂:1.50mmol/lpH7.8的磷酸缓冲液(PBS)。含0.1mmol/lEDTA2.220mmol/l甲硫氨酸：称3.2824g甲硫氨酸\,用50mmol/lpH7.8的磷酸缓冲液定溶至100ml（现配现用）。3.1.25mmol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）溶液（现配）：称NBT0.102g,用50mmol/lpH7.8的磷酸缓冲液(PBS)溶解定容至100ml.4.0.033mmol/l核黄素：称2.52mg用PBS溶解定容至200ml（遮光保存）。【实验步骤】1．酶液制备称取植物组织0.5g先加入2.5mlPBS，研磨匀浆后，再加入2.5mlPBS混匀，4℃下10000r/min离心15min上清液即为粗酶液。取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。2.酶活性测定取10ml小烧杯7只,3只测定样品,4只作为对照，按下表加入试计:试剂用量(ml)终浓度(比色时)50mmol/l(PBS)220mmol/lMet1.25mmol/lNBT0.033mmol/l核黄素酶液总体积4.050.30.30.30.055.013mmol/l75µmol/l2.0µmol/l对照以缓冲液代替酶液将上述试剂混匀后，1只对照烧杯至于暗处，另3只对照烧杯和样品一起置于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光一致，温度高时时间缩短，温度低时可适当延长）。最后在560nm处测定反应液的光密度。以不照光的对照烧杯作参比，分别测定其他各管的光密度。3.蛋白含量的测定步骤1的上清液经适当稀释后用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白含量.【实验结果及计算】SOD活性单位是以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。可按下式计算SOD活性：SOD总活性=SOD比活力=SOD总活性/蛋白质总浓度式中:SOD总活性以U/gFW,比活力单位以U/mg蛋白表示ACK为对照杯(光照)的光吸收值;AE为样品的光吸收值;V为样液总体积,V1为测定时样品用量,W为样重g.缩写：SOD：超氧化物歧化酶；CAT：过氧化氢酶；POD：过氧化物酶；MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：甲硫氨酸；NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS:磷酸缓冲液SOD的测定方法加样顺序：（V=3ml）磷酸缓冲液：1.5mlL-Met:0.3mlNBT:0.3mlEDTA-Na2:0.3ml核黄素：0.3ml酶液：0.05ml蒸馏水：0.25ml试剂配制：(1)0.05mol/LPBS：pH7.8(2)130mmol/LL-Met:1.9399gMet用PBS定容至100ml(3)750mmol/LNBT:0.06133g用PBS定容至100ml(避光保存)(4)100umol/LEDTA-Na2:0.03721g用PBS定容至1000ml(5)20umol/L核黄素:0.0753g用蒸馏水定容至1000ml(避光保存)注：（1）对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管(2)照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值SOD活性的测定方法[2005-10-3112:51:00|By:abingxu]0推荐pH7.8最适，按邵从本等（1993）方法。1.试剂：反应液：含13×10-3M甲硫氨酸（MW=149.21292），75×10-6MNBT（MW=817.7），2×10-6M核黄素（MW=376.36），100×10-9MEDTA，50×10-3M磷酸缓冲液，pH7.8。4.096225gNa2HPO4.12H2O，0.16576075gNaH2PO4.2H2O用蒸馏水溶解，加入0.484942g甲硫氨酸、0.01533gNBT、0.00075272g核黄素（扩大10倍，溶于10ml蒸馏水，取0.25ml，此2种药剂现用现加）及0.000037224gEDTANa2（配时扩大100倍，用蒸馏水定容100ml后，取0.75ml），定容至250ml，4℃避光保存。2．操作：取30支粗细、厚薄一致的洁净试管，分别加入3.98反应液，29支加20ul()酶液，另一支不加酶液加同样体积的提取缓冲液，以1支加酶的不作光照处理的为空白对照，余4000Lux照光20-25分钟后测OD560，每提取液重复3次，取平均值。3.计算：在上述条件下，抑制50％NBT光化还原的酶量定为一个酶单位，按ConstantineN.etal1977(Pl.Physiol.59:309-314)方法计算酶比活力。SODunits/mgprotein={[OD560(不加酶)/OD560（加酶）-1]×稀释倍数×4（反应液体积）}/[0.02（所加酶液ml数）×每ml酶粗提液含蛋白mg]超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD，EC1.15.1.1）参照Donahue等(1997)，Schickler和Caspi(1999)的方法。不同人工老化大豆种子的胚轴在液氮种迅速研磨程均匀粉末。约0.1g材料于3mL提取缓冲溶液（50mmolL－1Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH7.0，含1.0mmolL-1EDTA，0.05％（V/V）TritonX-100，2％（W/V）不溶性聚乙烯吡咯烷酮）中研磨成匀浆。经过10000×g，5min和16000×g，20min，4℃下两次离心后，取上清液进行SOD活性测定。或液氮冷却后存于－80℃。SOD酶活性测定利用SOD抑制氮蓝四唑（NBT）在光下被·O2－还原的反应。反应液为含13mmol·L-1甲硫氨酸（核黄素电子供体），75μmolL-1氯化硝基四氮唑蓝,16.7μmol·L-1核黄素（产生·O2－），0.1mmolL-1EDTA的50mmolL-1磷酸缓冲液(pH7.8)。在波长560nm处，检测吸光光度值。SOD活性以每mg蛋白抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位U。