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第十一章多肽与蛋白质类药物一、多肽和蛋白质药物的基本概念第一节概述（一）、多肽类药物多肽是α-氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物,它也是蛋白质水解的中间产物。N条多肽链按一定的空间结构缠绕纠结就构成了蛋白质。大分子蛋白质水解会生成多肽。1、多肽药物的功能特性多肽是生物体内重要的生物活性成分，主要有以下生理功能特性：☆（1）作为生理调节的活性分子，参与调节各种生理活动和特性。☆（2）多肽在生物体内的浓度很低（1×10-7mol/L就可发挥活性，有的甚至更低），但生理活性很强，具有多种多样的生化功能。如胆囊收缩素在千万分之一就可发挥作用。☆（3）分子小，结构易于改造，可通过化学合成的方法生产。如由中国首先合成的牛胰岛素，就属于一种含51个氨基酸的多肽。☆（4）活性多肽的合成过程往往是由蛋白质精加工剪切转化而来的，许多多肽之间都具有共同的来源、相似的结构。2.多肽类药物的分类主要有多肽激素、多肽类细胞生长调节因子、含有多肽成分的组织制剂：1、多肽激素（1）脑垂体多肽激素；促皮质素（ACTH），促黑激素,催产素，加压素（2）下丘脑激素；促甲状腺激素释放激素，生长素抑制激素，促性腺激素释放激素主要多肽类药物（3）甲状腺激素；甲状旁腺激素，降钙素（4）胰岛激素；胰高血糖素，胰解痉多肽（5）胃肠道激素；胃泌素，胆囊收缩素，肠泌素，肠血管活性肽，抑胃肽，缓激肽，P物质（6）胸腺激素；胸腺素，胸腺肽，胸腺血清因子2、多肽类细胞生长调节因子包括表皮生长因子(EGF)，转移因子(TF)，心钠素(ANP)等。3、含有多肽成分的组织制剂这是一类临床疗效确切，但其中所含的具体有效成分还不十分明了的制剂，主要包括骨宁、眼生素、血活素、氨肽素、妇血宁、蜂毒、蛇毒、安胎素、神经营养素、胎盘提取物、花粉提取物、脾水解物、肝水解物、心脏激素等。（二）蛋白质药物蛋白质药物可分为蛋白质类激素、血浆蛋白质、蛋白质类细胞生长调节因子、胶原蛋白等。主要蛋白质类药物有以下几种：1.蛋白质激素（1）垂体蛋白激素----生长素，催乳素，促甲状腺素，促黄体生成激素，促卵泡激素（2）促性腺激素----人绒毛膜促性腺激素(HCG)，绝经尿促性腺激素，血清促性腺激素（3）胰岛素及其它激素生长素释放抑制因子，是一种人脑激素，治疗肢端肥大症，50万个羊脑提取5mg.工程菌：7.5L培养液可得到5mg.肢端肥大症4.粘蛋白:胃膜素，硫酸糖肽，血型物质A和B等。5.胶原蛋白:明胶，阿胶6.碱性蛋白:硫酸鱼精蛋白7.蛋白酶抑制剂:胰蛋白酶抑制剂，大豆胰蛋白酶抑制剂8.植物凝集素:PHA，ConA3.蛋白质类细胞生长调节因子干扰素α、β、γ（IDN）,白细胞介素（1~16）（IL）神经生长因子等2.血浆蛋白质白蛋白，纤维蛋白溶酶原，血纤蛋白等硫酸鱼精蛋白是一种强碱，能与强酸性肝素钠或肝素钙形成稳定的盐而使肝素失去抗凝作用。抗肝素药。用于因注射肝素过量所引起的初出血.FDGF,IL,CSF,IFN,EPO,hGH的中文名称IFN：干扰素IL：白细胞介素hGH：生长激素FDGF：成纤维细胞衍化生长因子CSF：克隆刺激因子EPO：红细胞生成素二、多肽和蛋白质类药物特点1)基本原料简单易得多肽和蛋白质类药物主要以20种天然氨基酸为基本结构单元依序连接而得,代谢物氨基酸为人体生长的基本营养成分,可通过农产品发酵而制备。2)药效高，副作用低,不蓄积中毒多肽和蛋白质类药物本身是人体内源性物质或针对生物体内调控因子研发而得，通过参与,介入,促进或抑制人体内或细菌病毒中生理生化过程而发挥作用,副作用低,药效高,针对性强，不会蓄积于体内而引起中毒。3)用途广泛，品种繁多，新型药物层出不穷多肽和蛋白质类药物是目前医药研发领域中最活跃,进展最快的部分，是二十一世纪最有前途的产业之一。将20种基本氨基酸按不同序列相互连接,可得到品种繁多,可用于治疗各种类型疾病的多肽和蛋白质类药物。众多新型多肽和蛋白质类药物在治疗艾滋病，癌症，肝炎，糖尿病，慢性疼痛效果显著。4)研发过程目标明确,针对性强借助生命科学领域取得的大量研究成果,包括对各类疾病发病机理的揭示,对体内各种酶,辅酶,生长代谢调节因子的深入认识,可以针对性开展多肽和蛋白质类药物的研发。多肽和蛋白质类药物研发技术与方向1)化学合成方法2)改造生物活性多肽及现有多肽药物3)提高活性多肽及现有多肽药物档次4)针对具生物活性的多肽天然产物研发5)生物技术制备多肽和蛋白质药物三、多肽及蛋白质类药物的生产方法（1）化学合成法：化学合成法只能生产少部分多肽类药物。化学合成法借助化学催化剂，按一定的氨基酸序列秩序形成肽键。蛋白质药物一般具有复杂的空间结构，而形成这些空间结构还需要一些特殊的细胞因子参与起辅助作用，这些细胞因子是化学合成过程中无法提供的，所以化学合成不能用于生产相对复杂的蛋白质类药物。1953年，人类用化学合成法合成了有生物活性的多肽----催产素。（1）化学合成法：（2）天然动植物及重组动植物提取法（3）微生物及重组微生物发酵法（2）天然动植物及重组动植物提取法通过生化工程技术，从天然动植物中分离纯化。由于天然动植物中的有效成分含量过低，杂质太多，引起人们对重组动植物的重视。重组动植物只通过基因工程技术手段，将药物基因或能对药物基因起调节作用的基因转导入动植物细胞，以提高动植物合成药用成分的能力，再经过生化分离，制得生物制品。t-PA(tissue-plasminogenactivator)译成中文为组织纤溶酶原激活剂，人体内自然存在，同时也是临床上用于急性心肌梗死的一种生物蛋白药物，有18个半胱氨酸，9对二硫键t-PA组织型纤溶酶原激活剂的转基因羊（3）微生物及重组微生物发酵法通过基因工程菌发酵生产多肽和蛋白质药品，生产中期短、成本低、产品质量高。通过基因工程技术手段，把人体细胞内含有的合成某一多肽或蛋白质的基因分离出来，在结合一定的载体，转入特定的微生物细胞，通过微生物细胞将该多肽或及蛋白质的基因表达出来，以生产该类药品用于临床。目前，世界上生产的多肽和蛋白质药品，绝大多数均经过此方法生产。第二节动植物提取法生产多肽和蛋白质类药物一、概述（一）材料的选择蛋白质类药物的来源有动植物组织和微生物等，原则是要选择富含所需蛋白质多肽成分的，易于提取的无害生物材料。对天然蛋白质类药物，为了提高质量、产量和降低生产成本，对原料的种属，发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞都有一定要求，使得纯化工作相对容易。(1)种属：牛胰含胰岛素单位比猪胰岛素多，牛为4000IU/Kg胰脏，猪为3000IU/Kg胰脏.抗原性猪比牛低。猪与人胰岛素相比，只有1个氨基酸差异，而牛有3个氨基酸差异。（2）发育生长阶段：幼年动物的胸腺比较发达，老龄后逐渐萎缩，因此胸腺原料必须采用幼龄动物。肝细胞生产因子是从肝细胞分化最旺盛阶段的胎儿、胎猪或胎牛肝中获得的。若用成年的动物，必须经过肝脏部分切除手术后，才能获得富含肝细胞生长因子的原料。猪胰脏牛胰脏（3）生物状态：动物饱食后宰杀，胰脏中胰岛素含量增加，对提取胰岛素有利，但胆囊收缩素的分泌是胆汁排空，对胆汁收集不利。（4）原料来源：血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪颚下腺中提取，而稳定性以猪颚下腺来源为好，因其不含蛋白质水解酶。（6）对生物技术产品宿主菌或细胞的要求：大肠杆菌的产品提取大多要求破壁，有些可能会产生毒素。枯草杆菌和酵母菌虽然可克服上述毛病，但表达的蛋白质成分有缺乏糖基化等翻译及修饰的缺陷。动物细胞较好，如果用肿瘤细胞要考虑其安全性。（5）原料解剖学部位：猪胰脏中，胰脏尾部含激素较多，而胰脏头部分含消化酶较多。如果分别摘取则可提高各产品收得率。胃膜素以采取全胃粘膜为好，胃蛋白酶则以采取胃底部粘膜为好，因胃底部粘膜富含消化腺。猪胃(二)蛋白质类制品的分离纯化方法(1)根据分子大小轻重设计的方法。如离心分离法、筛膜分离法、凝胶过滤法等。(2)根据溶解度大小分离的方法、如盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法等。(3)按分子所带正负电荷多少分离的方法，如离子交换分离法、电泳分离法、聚焦层析法等。(4)按稳定性差异建立的分离方法，如选择性热变性法表面变性法等。(5)按亲和作用的差异建立的分离方法，如亲和层析法等.二、主要多肽类药物的制备1、胸腺素（thymocin）胸腺位于胸骨后面，紧靠心脏，呈灰赤色，扁平椭圆形，分左、右两叶，由淋巴组织构成。青春期前发充良好，青春期后逐渐退化，为脂肪组织所代替。胸腺是造血器官，分泌胸腺素，能产生淋巴细胞，并运送到淋巴结和脾脏等处。这种淋巴细胞对机体的细胞免疫具有重要作用。生长激素和甲状腺素能刺激胸腺生长，而性激素则促使胸腺退化。人体和动物都有免疫系统，包括特异性免疫和非特异性免疫，其中特异性免疫又分为体液免疫系统和细胞免疫系统。当某些外源生物（如细菌）或生物大分子（如蛋白质），也叫抗原，进入动物体后，会刺激动物体本能地产生相应的抗体，引起免疫应答，从而将进入的外源生物或蛋白质分解或清除。细胞免疫主要指机体受到异己物质抗原的刺激后，一类小淋巴细胞——依赖胸腺的T细胞发生增生、分化，直接攻击靶细胞或间接地释放一些淋巴因子从而使机体达到免疫的过程。体液免疫则是当机体受到抗原刺激后，来源与骨髓的小淋巴细胞——B细胞（即B型淋巴细胞）进行增生并分化为浆细胞，进而合成各类免疫球蛋白（即抗体），然后在体液中发挥免疫作用的过程。T淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞（胚胎期则来源于卵黄囊和肝）。在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。T淋巴细胞与激活的血小板T淋巴细胞嗜中性粒细胞Neutrophil嗜中性粒细胞Neutrophil嗜中性粒细胞Neutrophil嗜中性粒细胞Neutrophil嗜中性粒细胞Neutrophil嗜酸性粒细胞Eosinophil嗜酸性粒细胞Eosinophil嗜酸性粒细胞Eosinophil嗜酸性粒细胞Eosinophil嗜碱性粒细胞Eosinophil嗜碱性粒细胞Eosinophil嗜碱性粒细胞Eosinophil单核细胞Monocyte嗜碱性粒细胞Eosinophil嗜碱性粒细胞Eosinophil淋巴细胞Lymphocyte胸腺素（thymosin;thymin），-----是由胸腺分泌的一类促细胞分裂的含28个氨基酸残基的具有生理活性的多肽激素。可诱导造血干细胞发育为T淋巴细胞，具有增强细胞免疫功能和调节免疫平衡等作用。-----临床上常用的胸腺肽是从小牛胸腺发现并提纯的有非特异性免疫效应的小分子多肽。（1）结构和性质胸腺素组分5是由80℃热稳定的40-50种多肽组成的混合物，分子量在1000~15000之间，等电点在3.5~9.5之间。胸腺素组分5胸腺素组分5这一名称来源于生产加工过程，即以小牛胸腺为原料，采用一定的工艺提取纯化得到的第5组分。α区---pI5.0以下多肽。β区---pI5.0~7.0以下多肽γ区---pI7.0以上多肽（种类较少）根据等电点不同，可以将胸腺素组分5中所含多肽分为α、β、γ三个区，胸腺素组分5中，所含的多肽中并非每一种都有免疫活性，有活性的称为胸腺素，如胸腺α1、α5、α7，无活性的称为多肽，如β1等。胸腺素组分5作用与用途：作为免疫调节剂①原发性和继发性免疫缺陷病，如反复上呼吸道感染等；②自身免疫病，如肝炎，肾病，红斑狼疮，类风湿关节炎、重症肌无力等；③变态反应性疾病，如支气管哮喘等；④细胞免疫功能减退的中年人和老年人疾病，并可抗衰老。⑤肿瘤的辅助治疗。（2）生产工艺胸腺绞碎胸腺碎块生理盐水离心提取提取液（组分1）加热，去杂蛋白80℃，15min上清夜（组分2）丙酮沉淀－10℃丙酮粉（组分3）pH7.0磷酸盐缓冲液上清夜（组分4）加硫酸铵0.5饱和度调pH4盐析物超滤pH8Tris－HCl超滤液SephadexG－25脱盐，干燥胸腺素（组分5）硫酸铵0.25饱和度二、主要蛋白质类药物的制备一、人血浆白蛋白制剂的制备（prepara