蛋白多肽药物

第二节多肽、蛋白类药物一、概述1、多肽类生化药物是以多肽激素和多肽细胞生长因子为主的一大类内源性活性成分。多肽类药物二、多肽类药物的制备活性多肽是生化药物中非常活跃的一个领域，生物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺、组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的。（一）胸腺激素（Thymushormones）胸腺是一个激素分泌器官，对免疫功能有多方面的影响。胸腺依赖性的淋巴细胞群—T细胞直接参与有关免疫反应。胸腺对T细胞发育的控制，主要通过由胸腺所产生的一系列胸腺激素，促使T细胞的前身细胞—前T细胞分化、增殖、成熟为T细胞的各种功能亚群，由此控制调节免疫反应的质与量。现已知某些免疫缺陷病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤以及老年性退化性病变等皆与胸腺功能的减退及血中胸腺激素水平的降低有关。1、结构和性质胸腺素组分5是由在80℃热稳定的40~50种多肽组成的混合物，分子量在1000～15000之间，等电点在3.5～9.5之间。2、生产工艺3、工艺过程a.提取匀浆、离心b.加热去杂蛋白提取液80℃加热15min，c.沉淀-10℃丙酮，d.超滤取分子量在15000以下的超滤液。e.脱盐、干燥超滤液经SephadexG-25脱盐后，冷冻干燥得胸腺素。4、检验方法：活力测定：E-玫瑰花结升高百分数不得低于10％；分子量15000以下。5、作用与用途：为免疫调节剂。（二）促皮质素（Adrenocorticotropichormone，ACTH）1．结构和性质:垂体包括腺垂体和神经垂体，可分泌多种激素。促皮质素是从垂体前叶提取出来的一种多肽激素。维持肾上腺皮质的正常功能，促进皮质激素的合成和分泌。临床用于胶原病（风湿性关节炎、红斑狼疮），也可用于过敏症（严重哮喘、药物过敏、荨麻疹等）。改善老年人及智力迟钝儿童的学习和记忆能力。还可作为诊断试剂。易溶于水，等电点为6.6。在干燥和酸性溶液中较稳定，虽经100℃加热，但活力不减；在碱性溶液中容易失活。能溶解于70%的丙酮或70％的乙醇中。ACTH为39个氨基酸组成的直链多肽，种属差异仅仅表现在第25～33位上。ACTH的24肽即1～24位的片段（ACTH1～24）具有全部活性。这是因为ACTH的第24位氨基酸之后的部分，不参与同受体的作用，它仅维持整个多肽结构的稳定性。ACTH可被胃蛋白酶部分水解，但仍有活力，ACTH在溶液中存在着高度的α－螺旋。2、生产工艺732、717除盐羧甲基纤维素钠，搅拌、过滤717处理色素、热原、负离子梯度洗脱3、工艺过程：提取分离精制CMC（羧甲基纤维素弱酸）717处理色素、热原、负离子梯度洗脱。732、717除盐（动态吸附）4、检验方法ACTH粗品每1mg相当于1U以上，用小白鼠胸腺萎缩法测定；ACTH精品每1mg45U以上，用去垂体大白鼠的肾上腺维生素C降低法测定。（三）降钙素（Calcitonin，CT）1、结构和性质降钙素是一种调节血钙浓度的多肽激素，由甲状腺内的滤泡旁细胞（C细胞）分泌。抑制破骨细胞活力，阻止钙从骨中释放，降低血钙。临床用于：骨质疏松症、甲状旁腺机能亢进、成人高血钙症、畸形性骨炎是由32个氨基酸残基组成的单链多肽，N端半胱氨酸与7位半胱暗算形成二硫键，C端为脯氨酸，降钙素肽链的脯氨酸端与生物活性有密切的关系，去掉脯氨酸则失活。降钙素分子量约3500，溶于水和碱性溶液，不溶于丙酮、乙醇、氯仿、乙醚、苯、异丙醇及四氯化碳等，难溶于有机酸。水溶液中2~7℃可保存7天。降钙素在人及哺乳动物体内，主要存在于甲状腺、甲状旁腺、胸腺和肾上腺等组织中，鱼类则在鲑、鳗、鳟等的终鳃体里含量较多。各种不同动物来源的降钙素，氨基酸排列顺序有些差异。制造降钙素的原料主要有猪甲状腺和鲑、鳗的心脏或心包膜。离心，取上清，洗涤沉淀粉末，可进一步纯化2、生产工艺（四）表皮生长因子（Epidermalgrowthfactor，EGF）1、发现与医学成果1974年从人尿中提纯出人的表皮生长因子（hEGF）,其结构由53个氨基酸组成，分子量6201道尔顿，分子内有6个半胱氨酸组成的二硫键，形成3个分子内环型结构，组成生物活性所必须的受体结合区域。EGF无糖基部位，非常稳定，耐热耐酸，广泛存在于体液和多种腺体中，主要由颌下腺、十二指肠合成，在人体的绝大多数体液中均已发现，在乳汁、尿液、精液中的含量特异性地增高，但在血清中的浓度较低。众多的实验研究表明，EGF可刺激多种细胞的增殖，主要是表皮细胞、内皮细胞。用于角膜损伤、烧烫伤及手术等创面的修复和愈合取得了很好的疗效，Montalcini和Cohen教授因为发现表皮生长因子并分析其结构和作用机理，1986年诺贝尔生理学及医学获奖。2、生理作用：表皮生长因子通过与细胞表面的受体表皮生长因子受体(EGFR)结合而起作用。与表皮生长因子受体的高亲和力结合，激发受体内在的酪氨酸激酶的活性，从而启动了信号传导级联而导致多种生物化学变化，细胞内钙水平上升,增加糖酵解与蛋白质合成,增加某些基因(包括表皮生长因子受体)的表达,最终导致DNA合成和细胞增殖。3、美容领域的作用嫩肤作用滋润皮肤消除皱纹修复创伤预防色斑4、对人体的作用对骨骼系统的作用促进生成大量的成骨细胞、抑制破骨细胞。治疗骨质酥松、股骨头坏死、关节炎、风湿病和因钙缺乏导致的疾病。对消化系统的作用加强胃肠功能，促进消化酶的分解，增进食欲，治疗慢性胃炎。对血液系统的作用加强骨髓造血功能，促进干细胞生成，进而生成大量红细胞和白细胞。加强左心室厚度，增强心肌弹性力，高效治疗心脏病。有效清除血液中低密度蛋白，防止在血管壁沉积，治疗血栓。对呼吸系统的作用加强肺部细胞功能，修正气血屏障，消除肺部毒素，治疗肺气肿、肺供养不足和呼吸系统疾病。对内分泌系统的作用促进人体荷尔蒙生长，加强各种酶、荷尔蒙的分泌，增强肾功能，加强水的代谢，帮助体内排毒。对生殖系统的作用刺激性激素分泌，强壮性器官肌肉组织，加强性器官神经耐力，打开微循环，加快性器官充血。对免疫系统的作用刺激胸腺再生，加快淋巴T细胞、B细胞、吞噬细胞的生成，提高免疫功能，吞噬病毒病菌和癌细胞，治疗癌症和肿瘤。对神经系统的作用加快恢复神经系统功能，促进脑神经细胞、树突生成，逆转脑萎缩，加快深度睡眠，治疗老年性痴呆、神经衰弱、记忆力减退、神经性头痛等。5、表皮生长因子的生产工艺(1)表皮生长因子的生产工艺(2)高效价的抗重组人表皮生长因子(EGF)的制备：单克隆抗体以重组人表皮生长因子作为抗原,免疫Balb/c小鼠,以未免疫的Balb/c小鼠脾细胞为饲养细胞,运用细胞杂交瘤技术制备,间接ELISA法筛选产生针对人表皮生长因子的单克隆抗体细胞株;以体内诱生法产生腹水,并采用ProteinASepharose柱对其纯化表皮生长因子的生产工艺(3)蛋白类药物的制备一、概述二、主要蛋白质类药物的制备纯化根据目的蛋白与杂质之间的差异进行纯化。1.根据蛋白质的pI的不同进行纯化，其方法有：1）pI沉淀法2）pI沉淀法与盐析法相结合3）等电聚焦法2.蛋白质分子形状和大小的不同进行纯化，其方法有1）凝胶过滤2）超滤法3）离心法4）透析法3.蛋白质的溶解度不同进行纯化，其方法有：1)盐溶与盐析法2）结晶法3）有机溶剂沉淀法4.蛋白质电离性质不同进行分离：离子交换法5.蛋白质功能专一性不同进行纯化：亲和层析法、假亲和层析法6.蛋白质在溶剂系统中分配不同进行纯化：萃取法7.蛋白质的选择性吸附的性质进行纯化：吸附法8.蛋白质的其他特殊性质进行纯化（一）白蛋白（Albumin）1、结构和性质白蛋白又称清蛋白，是血浆中含量最多的蛋白质，约占总蛋白的55％。主要功能是维持血浆胶体渗透压。用于失血性休克、严重烧伤、低蛋白血症。白蛋白为单链，由575个氨基酸残基组成，分子量为65000，pI4.7，沉降系数4.6，电泳迁移率5.92。可溶于水和半饱和的硫酸铵溶液中，一般当硫酸铵的饱和度为60％以上时析出沉淀。对酸较稳定。在白蛋白溶液中加入氯化钠或脂肪酸的盐，能提高白蛋白的热稳定性，可利用这种性质，使白蛋白与其他蛋白质分离。人血浆中分离的白蛋白有两种制品：一种是从健康人血浆中分离制得的，称人血清白蛋白；另一种是从健康产妇胎盘血中分离制得的，称胎盘血白蛋白。制剂为淡黄色略粘稠的澄明液体或白色疏松状（冻干）固体。2、生产工艺（1）工艺路线：利凡诺和白蛋白在碱性条件下，可形成结合力很强的黄色粘稠络合物，难溶于水和碱液（2）工艺过程：提取、分离、精制利凡诺沉淀弱酸性，氯化钠超滤器浓缩热处理，灭活病毒除菌（过滤）。（二）人丙种球蛋白（γ-lmmunoglobulin）1、结构和性质免疫球蛋白是一类主要存在于血浆中、具有抗体活性的糖蛋白。对血清进行电泳后发现，抗体成分存在于β和Y球蛋白部分，故通称为免疫球蛋白（Ig）。免疫球蛋白约占血浆蛋白总量的20%。除存在于血浆中外，也少量地存在于其它组织液、外分泌液和淋巴细胞的表面。具有被动免疫作用，可用于预防流行性疾病如：病毒性肝炎、脊髓灰质炎、风疹、水痘＆丙种球蛋白缺乏症。2、生产工艺工艺路线：（三）、胰岛素1921年----从动物胰腺中提取出胰岛素，开创了人类胰岛素治的历史。1926年----重结晶胰岛素1930s----传统中、长效动物胰岛素1970s----单峰胰岛素和单组分胰岛素70年代末----半合成胰岛素1982年----采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上市90年代至今----重组人胰岛素类似物成功研发上市，包括超短效和长效人胰岛素类似物。临床：胰岛素依赖性糖尿病及糖尿病合并感染目前临床使用的胰岛素来源动物胰脏来源----经动物胰脏提取或适当提纯的猪、牛胰岛素半合成胰岛素----以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素重组DNA技术生产胰岛素----重组DNA技术生产人胰岛素、速效胰岛素、长效胰岛素1.结构与性质结构：51个氨基酸，有A（21）、B（30）两条链，两链之间由两个二硫键连接，在A链本身还有一个二硫键。胰岛素的前体是胰岛素原由连接肽（C肽）将A、B链相连，不同动物的C肽氨基酸组成也不同，C肽两端的4个碱性氨基酸被水解去除后，即形成一分子胰岛素和一分子无活性的C肽。性质胰岛素为白色或类白色粉末结晶。由于精制方法不同，在显微镜下观察，可分两种形态，一种为不规则细微颗粒,称“无定形”另一种为扁斜形六面体牛胰岛素分子量为5733，猪胰岛素分子量为5761，人胰岛素分子量为5781。胰岛素的等电点为5.30-5.35。胰岛素在pH值为4.5-6.5范围内，几乎不溶水，在室温下溶解度为10μg/mL；易溶于稀酸或稀碱溶液；在80%以下乙醇或丙酮中溶解；在90%以上乙醇或80%以上丙酮中难溶；在乙醚中不溶。胰岛素具有蛋白质的各种特殊反应：高浓度的盐（如饱和氯化钠、半饱和硫酸铵溶液）可使其沉淀析出，也能被蛋白质沉淀剂和三氯醋酸等沉淀，并有茚三酮、双缩脲等蛋白质的显色反应。2.生产工艺提取：冻胰块用刨胰机刨碎后加入2.3-2.6倍的86%-88%乙醇(W/V)和5%的草酸,在10-15℃搅拌提取3小时。离心，滤渣再用一倍量68-70%乙醇和0.4%草酸提取2小时，离心，合并乙醇提取液，沉淀用于回收。碱化、酸化：提取液在不断搅拌下加入浓氨水调pH值到8.0-8.4(液温10-15℃)立即进行矸滤，除去碱性蛋白质，滤液应澄清，并及时用硫酸酸化至pH值3.6-3.8。降温至5℃静置4小时以上，使酸性蛋白充分沉淀。减压浓缩：吸上层清液至减压浓缩锅内；下层用帆布过滤，沉淀物弃去，滤液并入上清液。清液在30℃以下减压蒸去乙醇，浓缩至浓缩液比重为1.04-1.06（约为原来体积的1/9-1/10）为止。4）去脂、盐析：浓缩液转入去脂锅，5分钟内加热至50℃，立即用冰盐水降温至5℃，静置3-4小时，分离出下层清液（脂层可回收胰岛素）。调pH值到2.3-2.5。于20-25℃在搅拌下加入27%(W/V)固体氯化钠，保温静置数小时，析出之物即为胰岛素粗品。5）精制①除酸性蛋白：盐析物按干重计算，加入7