生化分析仪检测原理

临床生化检验反应原理及报告审核检验科黄小虎全自动生化分析仪生化分析仪特点优点亮点自动化机械化的仪器设备模仿代替手工操作提高了工作效率减少了主观误差灵敏准确快速标准化生化分析仪分类1按结构原理分管道连续流动式分立式——常用离心式干片式——急诊常用2按测定速度分小型中型大型超大型（模块式）3按自动化程度分半自动全自动2004중점사업분야生化分析仪主要构成加样系统供排水系统构成比色系统光源比色杯单色器检测器数据处理系统样品转盘试剂仓取样装置基本原理临床生化分析仪最常使用的是——分光光度法分光光度法——是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。分光光度计组成光源样品池单色器检测器记录装置滤光器光吸收曲线溶液对不同波长光的吸收程度，通常用光吸收曲线来描述。在分光光度法中,以吸光度为纵坐标,以波长为横坐标作图可得光吸收曲线。浓度不同的同种溶液,在该种曲线中其最大吸收波长相同，相应的吸光度大小则不同，同一波长下摩尔吸数相同。Lambert-Beer（朗伯-比尔）定律当一束平行单色光通过均匀的非散射样品时，样品对光的吸光度与样品的浓度及厚度成正比A=kcbA---吸光度k---吸光系数c---溶液浓度b---液层厚度吸光系数定义：吸光物质在单位浓度及单位厚度时测得的吸光度。K值的大小取决于吸光物质的性质、入射光波长、溶液温度和溶剂性质等，与溶液浓度大小和液层厚度无关。但K值大小因溶液浓度所采用的单位的不同而异。讨论：1.Lamber-Beer定律的适用条件（前提）:入射光为单色光溶液是均匀，无散射溶液2.该定律适用于固体、液体和气体样品3.在同一波长下，各组分吸光度具有加和性，如果溶液中同时存在两种或两种以上的吸光性物质,则测得的该溶液的吸光度等于溶液中各吸光性物质吸光度的总和，即：A（a+b+c）＝Aa＋Ab＋Ac应用：多组分测定定量分析方法(1)标准曲线法(2)标准溶液对比法(3)吸光系数法标准曲线法——最经典方法前提：固定仪器和固定条件A=K*BC过程：配置标准溶液系列→分别测定A→得C~A曲线样品→测定A样→查得C样标准溶液对比法在相同的条件下，配制浓度为cs的标准溶液和浓度为cx的样品溶液，在最大吸收波长处，分别测定二者的吸光度值为As、Ax，依据朗伯-比尔定律得:As=KbcsAx=Kbcx则:cx=cs*Ax/AssCiCCX吸光系数法吸光系数法又称绝对法，是直接利用朗伯-比尔定律的数学表达式A＝Kbc进行计算的定量分析方法。在手册中查出待测物质在最大吸收波长处的吸光系数或,并在相同条件下测量样品溶液的吸光度A，则其浓度为：AcLLEA%1cm1max%1cm1E或检测方法1.终点法2.固定时间法3.连续监测法终点法终点分析法是基于反应达到平衡时反应产物的吸收光谱特征及其对光吸收强度的大小，对物质进行定量的一类分析方法。反应混合物进行一定时间反应后，达到平衡终点，即在显色反应处于稳定阶段时，监测其颜色对光的吸收强度，以此计算待测物浓度。终点时间的确认：一、根据时间-吸光度曲线如:Trinder（偶联终点比色法）反应测尿酸，反应曲线上3-5分钟时其A趋向稳定,故可将5分钟作为反应终点。二、根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定如:溴甲酚绿法测血清白蛋白分类终点法：一点终点法二点终点法免疫比浊法双波长法一点终点法一点终点法——在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时，选择一个时间点测定吸光度值。通常在反应终点附近连续读两个吸光度，求出两点的平均值，并根据两点的差值判断反应是否达到平衡。一点终点法的设置：以R和S混合之前的空气空白、水空白或试剂空白的吸光度值为测定计算基点，以反应达到平衡的吸光度读数减去空白读数，校准曲线通过零点且成直线，对于反应速度比较快的实验多用。多见于单试剂项目，如：总蛋白，白蛋白等。2019/10/1721AmT（时间）AS+R(吸光度）一点终点法反应曲线计算公式：C=(Am-Ab)*KAm----终点读数点的吸光Ab----试剂空白吸光度K----校正系数TP反应曲线蛋白质+Cu2+→Cu-蛋白质络合物550nm处吸收峰二点终点法第二试剂加入以前，选择某一点读取吸光度Am，经过一定时间后反应达终点后测第二个吸光度值An,利用两吸光度之差计算结果。第一点吸光度值由样本本身或第一试剂与样品的非特异性反应有关，相当于样品空白，可有效的消除样品自身的吸光度，如溶血，黄疸，脂血等的干扰。AnTAR2AmS+R1(吸光度）（时间）两点终点样本空白=S+R1S+R1+R2（体积校正因子）k0计算公式C=(An-K0*Am)*KCRE反应曲线肌酐在一系列酶的作用下生成H2O2，H2O2和4-氨基氨替比林反应生成红色醌类物质，在540nm处有吸收峰。Mg反应曲线在碱性溶液中，Mg与二甲苯胺蓝形成重氮盐类的紫色复合物，Mg2+浓度可由二甲苯胺蓝吸光度的下降，通过光度测定法来测定。免疫比浊法通过物质对光的散射或透射来测定物质含量的方法：散射比浊：特定蛋白分析仪透射比浊：自动生化分析仪通常作两点终点法分析，多采用多点校准。应用：用Ab测定Ag（主要为微量蛋白：IG、C、APOA1/B、ASO、RF、CRP等），要求Ab过量，此时Ag-Ab复合物的生成量随Ag的增加而递增，光散/透射强度与抗原量成正比。免疫比浊法优点：方法简便结果准确可用于自动化仪器检测缺点：抗体用量大达平衡时间长双波长法消除样品中对测定有干扰的物质的影响；在试样中含有两个组分a和b时，若要测定组分b,组分a有干扰，应设法消除组分a的吸收干扰。首先选择待测组分b的最大吸收波长λ1作为测量波长，然后用作图的方法选择参比波长λ2，使组分a在这两个波长处的吸光度相等。试样溶液在λ2和λ1两个波长处的吸光度之差，只与待测组分的浓度成正比，而与干扰组分的浓度无关干扰物质1.脂血：吸收光谱300--600nm呈下降趋势2.Hb：350nm、400nm、540nm、580nm吸收峰3.胆红素：300--500nm有吸收峰可见它们的吸收峰都较宽，且同测定波长有重叠现象。双波长法双波长测定优点：①消除噪音干扰②减少杂散光影响③减少样品本身光吸收的干扰固定时间法指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，这两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，利用这两点吸光度差值计算结果。如：苦味酸法测肌酐计算公式：C=(A2-A1)*KA1A2·●T(吸光度）●测定底物的消耗或产物生成的速度的化学方法称为连续监测法（又称动态分析法、速率法或动力学法）。在反应速度恒定期（零级反应期）来连续观察和记录一定反应时间内底物或产物量的变化。通过测定一段时间内吸光度的变化速率（△A/min）来计算待测物的浓度。酶活性测定如（ALT、AST、ALP、GGT等）常用连续监测法（速率法）酶促反应曲线连续监测法即零级反应速率法,亦称斜率法在较长反应时间区段内(90-180秒)，每隔一定时间(5~30秒)读取一次吸光度值，至少读取4点，得到3个以上△A，最后算出反应速率△A/min。uTuuuVVltALU610/酶促反应进程曲线2019/10/1738A1TAS+R1R2A2(吸光度）（时间）连续监测法A/min=[(A2-A1)-(空白)]/(t2-t1)t2t1连续监测法特点与固定时间法相比，属于即时观测，无需停止酶促反应、不需添加其他呈色试剂，且可将多点的测定结果绘图连线，快速、直观查看酶促反应进程，很容易找到呈直线的线性期，检查到是否偏离零级反应。典型酶联法反应曲线ALT反应曲线AMY反应曲线生化结果报告审核责任心不强，未对结果进行认真审核对检测仪器或试剂方法学不够了解工作经验不足对仪器检测的结果及室内质控结果过于相信1.结合质控判断结果GLO=TP—ALB2.结合临床资料审核结合病人的性别、年龄、临床诊断、其他检查结果审核例：某病人检测的TP为110g/L，该标本没有脂血等影响检测结果的因素临床诊断：多发性骨髓瘤另：胰岛素与低血糖、病人输注药物对结果的影响检验项目间的内在联系各检测参数间存在大小、比例、逻辑关系例：TCHDL-C+LDL-C、TBIDBICKCK-MBLDHα-HBDH影响检验结果的因素试剂线性范围：了解检验项目试剂的线性范围，对超过或低于范围的项目，必须进行相应的减量稀释或增量后重新测定。线性范围在实际工作中，用连续监测法会遇到检验结果为0或者负值的情况，此时不能盲目相信该结果低就出具低值报告，应查看其反应曲线例：某病人的尿液AMY检测结果为0U/L其反应曲线如下图：AMY反应曲线AMY反应曲线分析分析：由于测定物质浓度过高处理：对测定物质进行十倍左右的稀释再测定，直到反应曲线恢复正常结果才可靠AMY反应曲线AMY反应曲线第一次稀释后检测项目的方法学分析：CK是由M和B两类亚基组成的二聚体，其构成为CK-MB(心型)约占0-3%、CK-MM(肌型)约占97-100%、CK-BB（脑型）约占0-1%影响检验结果的因素检测项目的方法学：要了解该项目试剂采用的方法学：例：某病人在测定心肌酶谱时，其CK:246U/L、CK-MB:286U/L，标本无溶血等因素影响,其结果中CK-MB﹥CKCK-MB采用的检测方法为免疫抑制法正常人体中，CK同工酶中CK-MM﹥CK-MB﹥CK-BB,其中CK-BB含量极少，可忽略。免疫抑制法正是建立于忽略CK-BB的基础上。采用抗体抑制其M亚基活性，使CK-MM失去活性，而CK-MB失去一半的活性。单测定B亚基的活性，其结果×2即为CK-MB活性。由于在患轻度或中度脑损伤、脑血管意外及脑手术后造成脑组织发生实质性损害的病人中，CK-BB会升高，这时该方法测定的CK-MB的活性相当于是CK-MB+2CK-BB的活性之和，造成CK-MB活性假性升高。检验标本的影响标本脂血会使反应浊度增加，透光度下降，吸光度增加，从而造成检验结果不准确。如TP、TG、UA显著增高，GGT显著下降或为0标本溶血会使K+、ALT、AST、LDH等检验结果显著升高抗凝剂的错误使用仪器性能影响仪器老化、故障、清洗管道堵塞、水质不纯等均会对检验结果造成影响光路老化：表现为CK-MB,ALP,ALT、AST等项目结果重复性较差水质不纯、反应杯清洗不干净：表现为无机物质结果不准检验结果的总体趋势即使质控在控，也要注意当日检验结果的总体的分布趋势如K+的参考区间为3.5—5.5，中值为4.5，如果当日结果大部分甚至全部低于4.5，即使当日质控在控，任要考虑结果是否偏低，应重新校准、质控后再测定如在质控中TC(-1S),HDL(+1S),LDL(+1S),虽然在控，如出现大部分HDL+LDL﹥TC，也应考虑重新对三项目校标、质控后再测定总结不要盲目相信仪器检测的结果一定准确检验人员要增强对报告审核的责任心检验人员应加强对专业知识的学习和掌握,了解仪器的性能及各项目的方法学和反应原理对检验标本的状态要认真确认对有疑问或报警的结果要查看反应曲线加强与临床科室的沟通