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第十九章肠杆菌科及检验本章考点：1.概述（1）概念（2）命名与分类原则（3）共同特点（4）自然与人体内的分布（5）微生物学检查方法（6）临床意义2.埃希菌属、沙门菌属、志贺菌属、变形杆菌属、耶尔森菌属（1）生物学性状（2）微生物学检查法（3）临床意义一、概述和通性（一）概念肠杆菌科是由多个菌属组成，其生物学性状相似，均为革兰阴性杆菌。大多数肠道杆菌属于正常菌群，作为条件致病菌而引起疾病。其中包括常引起腹泻和肠道感染的细菌（埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、耶尔森菌属）和常导致院内感染的细菌（枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、多源菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、普罗威登菌属和摩根菌属），以及一些在一定条件下偶可引起临床感染的细菌。（二）分类根据《伯杰系统细菌学手册》（1984年）将肠杆菌科的细菌分为20个属即埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属、哈夫尼亚菌属、爱德华菌属、普罗威登斯菌属、变形杆菌属、摩根菌屑、耶尔森菌属等。（三）生物学特性1.形态与染色革兰阴性杆菌，其菌体大小为（1.0～6.0）μm×（0.3～1.0）μm。多数有周鞭毛，除外志贺菌属、克雷伯菌属、鼠疫耶尔森菌和EIEC无鞭毛。均不形成芽胞，少数菌属细菌可形成荚膜。2.培养：需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在普通琼脂培养基和麦康凯培养基上均能生长并形成中等大小的S型菌落，液体培养基中呈混浊生长。3.生化反应：发酵葡萄糖产酸、产气，乳糖发酵试验:肠道非致病菌（＋），肠道致病菌（－）（除外变形杆菌）。肠杆菌科定科试验主要项目是革兰阴性杆菌、触酶阳性，氧化酶阴性，硝酸盐还原试验阳性。4.抗原构造：包括菌体（O）抗原，鞭毛（H）抗原和表面抗原（如Vi抗原、K抗原）3种。5.变异：包括菌落S～R变异，鞭毛H～O变异和耐药性或生化反应性质的改变。6。抵抗力：不强。加热60℃，30分钟即被杀死。不耐干燥，对一般化学消毒剂敏感。对低温有耐受力，能耐胆盐。（四）致病性肠杆菌科细菌种类多，可引起多种疾病：1.致病性肠道杆菌：以肠内感染为主，腹泻为共显症状，引起急慢性肠道感染、食物中毒、旅游者腹泻及肠热症等。2.条件致病菌：为医院感染主要病原菌，出现移位感染。（五）微生物学检验1.分离培养：将粪便或肛拭标本立即接种在肠道菌选择培养基上或先增菌后再分离；血、尿或脓汁等其他标本原则上不使用选择培养基。分离纯菌后，根据菌落特点，结合革兰染色及氧化酶反应结果作进一步鉴定。2.鉴定（1）初步鉴定：原则是：①确定肠杆菌科的细菌，应采用葡萄糖氧化-发酵试验及氧化酶试验与弧菌科和非发酵菌加以鉴别；②肠杆菌科细菌的分群，多采用苯丙氨酸脱氨酶和葡萄糖酸盐试验，将肠杆菌科的细菌分为苯丙氨酸脱氨酶阳性、葡萄糖酸盐利用试验阳性和两者均为阴性反应三个类群；③选择生化反应进行属种鉴别。表5-19-1肠杆菌科的初步分类菌属名苯丙氨酸葡萄糖酸盐变形杆菌属＋－普罗威登斯菌属＋－摩根菌属＋－克雷伯菌属－＋肠杆菌属－*＋*沙雷菌属－＋哈夫尼亚菌属－＋埃希菌属－－志贺菌属－－沙门菌属－－枸橼酸杆菌属－－爱德华菌属－－耶尔森菌属－－*有例外将选择培养基或鉴别培养基上的可疑菌落分别接种克氏双糖铁琼脂（KIA）和尿素-靛基质-动力（MIU）复合培养基管中，并根据其六项反应结果，将细菌初步定属。（2）最后鉴定：肠杆菌科各属细菌的最后鉴定是根据生化反应的结果定属、种，或再用诊断血清做凝集反应才能作出最后判断。二、埃希菌属（一）概念埃希菌属包括5个种，即大肠埃希菌、蟑螂埃希菌、弗格森埃希菌、赫尔曼埃希菌和伤口埃希菌。临床最常见的是大肠埃希菌。大肠埃希菌俗称大肠杆菌，大多数菌株是人类和动物肠道正常菌群。（二）生物学特性（性状）1.形态与染色：为革兰阴性短杆菌，（1.0～3.0）μm×（0.4～0.7）μm。多数有周鞭毛，能运动。有菌毛、荚膜及微荚膜。2.培养特性：兼性厌氧菌，营养要求不高，在普通营养肉汤中呈浑浊生长。普通营养琼脂上呈灰白色的光滑型菌落。血琼脂平板上，少数菌株产生溶血环。在伊红美蓝琼脂上，由于发酵乳糖，菌落呈蓝紫色并有金属光泽。麦康凯和SS琼脂中的胆盐对其有抑制作用，耐受菌株能生长并形成粉红色菌落。3.生化反应：吲哚、甲基红、V-P、枸橼酸盐试验（IMViC试验）为++--（肠杆菌属多为--++）。克氏双糖铁琼脂（KIA）上斜面和底层均产酸产气，H2S阴性。动力、吲哚、尿素（MIU）培养基的生化反应为++-。4.抗原结构：大肠埃希菌的抗原由菌体抗原（O）、表面抗原（K）和鞭毛抗原（H）三种构成。现已知有171种O抗原，100种K抗原和56种H抗原。一个菌株的抗原类型由特殊的0、K和H抗原的代码表示，其血清型别的方式是按0：K：H排列，例如0111：K58（B4）：H2。（二）致病性主要是侵袭力、内毒素、肠毒素等致病因素引起各种炎症（如胆囊炎、泌尿系感染、肺炎、新生儿脑膜炎、伤口感染、菌血症及腹泻等）。内毒素还可引起发热、休克、DIC等。1.肠道外感染：主要由正常菌群条件致病，以泌尿系统感染常见，高位严重尿道感染与特殊血清型大肠埃希菌有关。如菌血症、胆囊炎、腹腔内脓肿。2.肠道感染：致病性大肠埃希菌有下列五个病原群。（1）肠产毒型大肠埃希菌（ETEC）：引起霍乱样肠毒素腹泻（水样泻）。（2）肠致病型大肠埃希菌（EPEC）：主要引起婴儿腹泻。（3）肠侵袭型大肠埃希菌（EIEC）：可侵入结肠黏膜上皮，引起志贺样腹泻（能产生粘液脓血便）。（4）肠出血型大肠埃希菌（EHEC）：又称产志贺样毒素（VT）大肠埃希菌（SLTEC或UTEC），其中O157：H7可引起出血性大肠炎和溶血性尿毒综合征（HUS）。临床特征为严重的腹痛、痉挛，反复出血性腹泻，伴发热、呕吐等。严重者可发展为急性肾衰竭。（5）肠粘附（集聚）型大肠埃希菌（EAggEC）：也是新近报道的一种能引起腹泻的大肠埃希菌。3.CDC将大肠埃希氏菌O157：H7列为常规检测项目EHEC的血清型50种，最具代表性的是O157：H7。在北美许多地区，O157：H7占肠道分离病原菌的第二或第三位，是从血便中分离到的最常见的病原菌，分离率占血便的40%，6、7、8三个月O157：H7感染的发生率最高。且0157是4岁以下儿童急性肾功衰的主要病原菌，所以CDC提出应将大肠埃希氏菌0157：H7列为常规检测项目。（三）微生物学检验1.标本采集：肠道感染可采集粪便；肠道外感染可根据临床感染情况采集中段尿液、血液、脓汁、胆汁、脑脊液、痰、分泌液等。2.检验方法及鉴定（1）涂片与镜检：脓汁及增菌培养物发现单一革兰阴性杆菌，可初步报告染色、形态、性状供临床用药参考。（2）分离培养：粪便标本可用弱选择鉴别培养基进行分离，脓汁等可用血平板分离，取可疑菌落进行形态观察及生化反应。（3）鉴定1）初步鉴定：根据菌落特征，涂片染色的菌形及染色反应，取纯培养物作生化反应。凡符合KIA：A／A或K／A、产气或不产气、H2S-；MIU：动力+或-、吲哚+、脲酶-；氧化酶-，IMViC:++--，可鉴定为大肠埃希菌。2）致病性大肠埃希菌:EPEC的鉴定：EIEC的鉴定：应与志贺菌相鉴别，两者的主要鉴别试验可用醋酸钠和葡萄糖铵利用试验及粘质酸盐产酸三种试验。大肠埃希菌均为阳性，而志贺菌均为阴性。ETEC毒素的检测：采用改良Elek法测定LT并采用乳鼠胃内灌注法检测ST。EHEC的血清学鉴定：EAEC的鉴定：检测细菌对HEP-2细胞或Hela细胞的粘附性。肠道外感染，经涂片染色，分离培养后，生化鉴定到种；由于大肠埃希菌是超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的主要产酶株，该酶由质粒介导。对ESBLs产酶株所致感染需要采用碳青酶烯类或内酰胺类抗生素／酶抑制剂或头霉菌素类进行治疗。肠道内感染还需做血清分型、毒素测定或毒力试验。食物、饮料、水等卫生细菌学检查，主要进行大肠菌群指数检测。三、志贺菌属志贺菌属是人类细菌性痢疾最常见的病原菌，通称痢疾杆菌。根据生化反应与血清学试验该属细菌分为痢疾、福氏、鲍氏和宋内志贺菌四群。CDC分类系统（1989）将生化性状相近的A、B、C群归为一群，统称为A、B、C血清群，将鸟氨酸脱羧酶和β-半乳糖苷酶均阳性的宋内志贺菌单列出来。我国以福氏和宋内志贺菌引起的菌痢-最为常见。（一）生物学特性1.形态与染色：革兰阴性短小杆菌，（2～3）μm×（0.5～0.7）μm，无荚膜，无芽胞，无鞭毛，有菌毛。2.培养特性：需氧或兼性厌氧，液体培养基中呈浑浊生长，在普通琼脂平板和SS培养基上形成中等大小、半透明的光滑型菌落，宋内志贺菌可形成扁平、粗糙的菌落。3.生化反应：志贺菌属的细菌KIA：K／A、产气-／+、H2S-，MIU：动力-、吲哚+／-、尿酶-，氧化酶-，不产生赖氨酸脱羧酶，氧化酶试验阴性。4.抗原结构：志贺菌属只有O抗原而无鞭毛抗原，个别菌型及新分离菌株有K抗原。（二）致病性致病物质：侵袭力：菌毛粘附于肠粘膜上皮细胞，诱导细胞内吞。内毒素：破坏肠粘膜；肠壁通透性；肠壁植物神经——腹痛，腹泻，里急后重，粘液脓血便。外毒素（志贺毒素，ST）：肠毒素活性；细胞毒活性；神经毒活性所致疾病：细菌性痢疾，简称菌痢。1.急性菌痢。2.中毒性菌痢。3.慢性菌痢。传染源为病人和带菌者，经粪口传播。（三）微生物学检验1.标本采集尽可能在发病早期及治疗前采集新鲜粪便，选择脓血便或粘液便，必要时可用肛拭子采集。2.检验方法及鉴定（1）分离培养：取粪便（粘液或脓血部分）或肛拭标本接种GN肉汤增菌及再进行分离培养。一般同时接种强弱选择性不同的两个平板。强选择鉴别培养基可用沙门、志贺菌选择培养基（SS）；弱选择培养基可用麦康凯或中国蓝培养基。培养18～24h后选取可疑菌落进行下列鉴定。（2）鉴定1）初步鉴定：挑选可疑菌落3～4个先用志贺菌属多价诊断血清作试探性玻片凝集试验。将试探性凝集试验阳性的菌落至少接种2～3支KIA和MIU，经35℃培养18～24h，凡符合KIA：K／A、产气-／+、H2S-，MIU：动力-、吲哚+／-、尿酶-，并结合试探性玻片凝集试验阳性结果可鉴定为志贺菌属。2）最后鉴定3.与类志贺邻单胞菌和伤寒沙门菌的鉴别：可用动力和氧化酶试验加以鉴别，志贺菌均为阴性，而类志贺邻单胞菌为阳性。伤寒沙门菌硫化氢和动力阳性，能与沙门菌属因子血清（0多价A-F群或Vi）凝集而不与志贺菌属因子血清凝集。（四）防治原则人工主动免疫用于预防目前尚不理想，治疗细菌性痢疾一般首选氟喹诺酮类抗生素。四、沙门菌属（一）生物学特性1.形态与染色：本属菌为（0.7～1.5）μm×（2.0～5.0）μm，无芽胞，无荚膜的革兰阴性直杆菌。除鸡沙门菌外都有周身鞭毛，能运动，多数有菌毛。2.培养特性：营养要求不高，在普通琼脂培养上即能生长，在液体培养基中呈均匀混浊。在SS琼脂和麦康凯琼脂培养基上35℃～37℃24h可形成直径约2～4mm的透明或半透明菌落，对胆盐耐受。产H2S者在SS琼脂上形成黑色中心。3.生化反应：除亚利桑那菌外均不能发酵乳糖，大多数IMViC试验为-+-+，KIA：K／A、产气+／-、H2S+／-，MIU：动力+、吲哚-、脲酶+。4.抗原结构：主要由0抗原和H抗原组成，部分菌株有类似大肠杆菌K抗原的表面抗原，与细菌的毒力有关，故称Vi抗原。（1）0抗原：即菌体抗原。沙门菌属的菌体抗原有58种，以阿拉伯数字依次标记：根据沙门菌有共同的O抗原这一特点，分类学者将有共同抗原的细菌归为一组，这就使沙门菌分成42个群（或组）。即A、B、C……Z和O16～O67群。每群都有群特异性抗原，如A群O2、B群04、D群O9等。（2）H抗原：即鞭毛抗原。H抗原是定型的依据。沙门菌H抗原有两相，第一相为特异性抗原，用a、b、c……表示；第二相为共同抗原，用1、2、3……表示。（3）表面抗原：已证实沙门菌属有Vi、M和5抗原三种。Vi抗原加热60℃30min或经石炭酸处理被破坏，其存在时可阻止0抗原与相应抗体发生凝集。5.变异性（1）S～R变异，菌落光滑型经人工培养传代后逐渐变成粗糙型。此时菌体表面的特异多糖抗原丧失，