第五章愈伤组织的诱导、形成及分化

第五章愈伤组织的诱导、形成及分化第一节愈伤组织的诱导和形成第二节愈伤组织形态建成第三节愈伤组织的形成及其形态建成的某些生理生化基础为什么进行愈伤组织培养？①无性繁殖，大量扩繁；②为细胞悬浮培养和次生代谢产物生产与利用、原生质体培养和细胞融合提供材料；③为植物体细胞无性系变异、细胞突变体筛选创造适宜的体系和基础；④为外源基因的遗传转化提供便于保存和利用的操对象；⑤为离体研究植物组织和细胞分裂、分化、代谢和状态的转变创造适宜的材料和体系。如何获得符合要求的愈伤组织？1、选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶是最常用的外植体，特别是幼胚。2、选择适宜的培养基：配制生长素和细胞分裂素浓度的比例；3、继代选择：选择疏松性好、细胞状态好的细胞继代培养。1、愈伤组织(Callus)：愈伤组织是在离体培养条件下，经植物细胞脱分化和不断增殖所形成的无特定结构的组织。2、愈伤组织的类型：CallusarisingfromleaftissueCallusarisingfromvasculartissue维管组织CallusarisingfromroottissueCallusarisingfromembryotissue（胚胎）Photoindicatingwherethecallus(c)arisesfromFriablecallusHard/lignifiedcallusCallusexudingstickypoly-saccharidesRhizogeniccallusRedwhitecallusGreencallusYellowcallus一、愈伤组织的诱导和形成1、愈伤组织形成过程：外植体＋培养基＋环境愈伤组织2、愈伤组织形成的三个时期：诱导期、细胞分裂期、细胞分化期愈伤组织形成诱导期分裂期分化期改变原来的分化方向和代谢方式，合成代谢加强，合成大量蛋白质和核酸物质为细胞的分裂和增殖奠定基础外植体外层细胞开始分裂，细胞脱分化，愈伤组织结构疏松，缺少组织结构，颜色浅而透明特点Callus表层细胞分裂逐渐停止，而转向其内部的局部地区，并改变分裂面的方向，出现瘤状结构外表，Callus中可以发现维管组织，但不形成维管系统■诱导期○愈伤组织诱导期又称启动期，是指外植体组织受外界条件刺激后，开始改变原来的分裂方向和代谢方式，合成代谢活动加强，大量合成蛋白质和核酸物质，为细胞分裂做准备。○诱导期的长短因植物种类、外植体的生理状态和外部因素而异■分裂期外植体在培养基上经过离体诱导后，外层细胞开始发生分裂，细胞脱分化。愈伤组织的细胞分裂快，结构疏松，缺少组织结构，颜色浅而透明。分裂期的细胞分裂局限在愈伤组织的外缘，主要是垂周分裂。**愈伤组织进入分裂期时，外植体的脱分化因植物种类、基因型、外植体种类和生理状况而有很大差异。**如烟草、胡萝卜等脱分化很容易，而禾谷类的脱分化较前者难；花器官脱分化较易，而茎叶则较难；幼茎组织脱分化较易，而成熟的老组织较难。**进入分裂期的愈伤组织，如仍在原来的培养基上继续培养，将发生分化，产生新的结构，若及时转移到新鲜的培养基上（继代培养），则愈伤组织可无限制地进行细胞分裂增殖，维持不分化的状态。愈伤组织诱导形成过程小麦幼胚分裂期诱导期分裂期分化期分化期■分化期**停止分裂的细胞发生生理生化代谢变化，形成不同形态和功能的细胞。细胞体积不再减少，最明显的特征是生长着的愈伤组织细胞的平均大小突然不再减少，而保持相对稳定。**愈伤组织表层细胞的分裂逐渐减慢直至停止，突然转向愈伤组织内部深处的局部地区，并改变分裂面方向，出现瘤状结构外表和内部分化。**出现瘤状结构的拟分生组织成为暂不再进一步分化的生长中心。分化的愈伤组织中有维管组织出现，但不形成维管系统，呈分散的节状和短束状结构。愈伤组织颜色1、Callus无任何形态结构，新鲜愈伤组织颜色为奶黄色或白色有光泽，少数也有淡绿色或绿色；老化的愈伤组织则转变为黄色至褐色。愈伤组织生长周期2、愈伤组织生长周期为2－3周。一般2－3周继代一次。**继代时应注意愈伤组织分割。二、愈伤组织保持与继代培养**愈伤组织在分裂期会出现导管细胞，筛管细胞，分泌细胞，毛状体细胞及木栓细胞等，并出现由小而密集的分裂细胞构成的细胞团，称为拟分生组织。**这些区域化的细胞团往往在以后分化中称为形成芽原基及根原基的中心，愈伤组织也经常呈颗粒状的外形，这些颗粒中含有韧皮部、木质部和形成层组织，这种具有类似微管组织的愈伤组织颗粒也具有分化形成不定芽和不定根的能力。拟分生组织愈伤组织继代时间与植株再生能力与遗传稳定性1、愈伤组织保持时间已诱导并建立起来的愈伤组织可以长期保存，如有报道大豆细胞系的愈伤组织在24℃和弱光下已保持15年。2、继代时间与植株再生能力及变异A、以往研究认为继代时间长再生能力减弱甚至丧失，但目前多数研究认为长期继代培养的愈伤组织仍有再生能力。B、继代时间与变异不同激素组合和浓度对蚕豆愈伤组织细胞倍性及染色体畸变的影响**愈伤组织遗传上的不稳定性因基因型、外植体、培养基成分和培养时间而异。**同基因型的同一种外植体在不同培养基上会产生不同的变异。**组织培养中的遗传变异是不可逆的，这种遗传上的改变可以是染色体畸变，细胞核破碎，或者多倍体以及分子水平上的改变。**培养基成分，特别是外源激素的成分与变异的产生密切有关。注意：第二节愈伤组织形态建成一、愈伤组织形态建成的方式愈伤组织形态建成方式体细胞胚胎途径再生植株通过产生单极性不定芽或不定根，在不定芽下方长出不定根或在不定根上产生不定芽，并在二者之间分化出维管束组织而形成完整植株愈伤组织仅分化出不定根或不定芽，形成无根苗或无苗根在愈伤组织的邻近部位分化出不定根和不定芽，二者通过维管束组织结合形成完整植株非体细胞胚胎途径再生植株大型工业纸浆用绵竹体细胞无性系诱导与筛选研究无根苗形成有根苗①②③④⑤Developmentoforgans(roots,buts,shoots,etc.)orembryos胚胎(embryo-likestructures)Vegetativepropagation体外营养繁殖ofplantsinvitro二、具形态建成和不具形态建成能力的愈伤组织**外植体细胞经离体诱导所形成的愈伤组织并不完全都具有形态建成的能力。**具有形态建成能力的愈伤组织都具有一定的形态结构特点。**具形态建成和不具形态建成能力的愈伤组织之间的差异是相对的，有时通过控制培养条件，尤其是生长调节物质和继代的方式可以调控其进行形态建成。三、Callus诱导、增殖及形态建成调控不同物种、基因型或外植体在不同培养条件下可以形成不同类型的愈伤组织，有的仅能诱导形成非胚性愈伤组织，而有的在适宜条件下则被诱导形成胚性愈伤组织，二者具有明显的不同特点。表4.1春小麦胚性与非胚性愈伤组织的特点项目胚性愈伤组织非胚性愈伤组织颜色淡黄白色表面光滑粗糙质地坚硬但易碎松散，水渍状胚性细胞的多少大量极少或无细胞形态小，圆球形管状或不规则形状细胞质浓厚，染色深稀薄，染色浅细胞核及核仁核明显、大，核仁大核小，核仁小，或无核四、愈伤组织诱导、增殖及其形态建成的调控愈伤组织诱导、增殖及形态建成是一个连续的过程,主要受植物种类、基因型、外植体、培养基和培养环境等因素的调控。图小麦幼胚愈伤组织诱导与植株再生示意图（东北农业大学小麦研究室，李文雄，曾寒冰，1990）起始材料培养基培养环境Callus诱导、增殖和形态建成物种基因型外植体种类、生理年龄培养基类型硝酸钾含量较高的培养基，如B5、N6含盐量中等培养基，如H和Nitsch，大量元素为MS的1/2，微量元素种类减少，但维生素种类比MS多低盐浓度培养基，如WS和HE有利利于根的离体诱导植物生长激素含盐量较大的培养基，如MS及其改良培养基（较高浓度硝酸盐、铵盐、钾盐，较全的微量元素），以及LS和BL培养基图：影响愈伤组织诱导、增殖和形态建成的因素1、基因型—重要影响因素**在离体培养过程，对起始材料的选择是十分重要的。**基因型是控制愈伤组织形态建成的关键。不同物种的外植体诱导的愈伤组织器官分化明显不同，如烟草、胡萝卜、苜蓿等较易发生器官分化，而禾本科（禾谷类）、豆类、棉花等的愈伤组织形态建成相对较难。**同属不同种，甚至同一物种不同品种的愈伤组织器官分化的能力也不同。马铃薯不同基因型对愈伤组织诱导的影响不同基因型马铃薯愈伤组织在耐盐培养基上植株再生表1不同基因型出愈率Table1Thecomparationofcallusinductionratebetweengenotypes出愈率initiatingrate基因型genotype重复1replicate1％重复2replicate2％重复3replicate3％平均average％F值Fvalue辽1094.396.892.194.4东农774291.089.589.790.1Roblin85.389.587.587.4F=28.67**东农775785.788.286.486.8新克旱9NXK978.276.978.878.8表3高粱花序外植体供体基因型及其愈伤组织年龄对其分化成植株的影响基因型再生植株数不同年龄的愈伤组织再生植株的数目（天数/继代数）40~160/2~4160~220/5~6220~310/7~91S315094890033151S82605991541632821S072448932216701S6881516322118761S28302462133301S42255204467311S876829011141138SC0167-14E11470总数361924726355122、外植体一般而言，分化水平较低的薄壁细胞和处于分裂的分生组织细胞较易诱导出愈伤组织。薄壁细胞分化水平较低，有较大发育的可塑性，其进行分裂的潜力可保持很多年，如25年树龄的椴属茎的薄壁细胞还可以诱导形成愈伤组织。分生组织细胞分裂潜能强，细胞分裂是脱分化形成愈伤组织的前提，因此是诱导愈伤组织适合的外植体。不同器官作为外植体所诱导的愈伤组织，其器官发生能力，有的植物差别不大，如烟草和水稻；而有的则明显不同，如翅鞘莎，以根、茎和叶为外植体时，愈伤组织的分化带有器官来源的特征，如根外植体的愈伤组织易分化出根。Fig.2.VariouscallusmorphologyfromgenerativepartsinVV024-6ofAlstroemeriaA:Callusinductionfromovary（子房）B:Callusfromovule(胚珠)C:Callusfromanther（花药）D:Formationofglobularembryostructure（球形胚胎结构）不同外植体胚性愈伤组织发生愈伤组织类型7742新克旱9XinKehan胚性愈伤组织embryogeniccallus++--非胚性愈伤组织non-embryogeniccallus++++基因型genotypecallustype成熟胚matureembryo幼穗immaturespike成熟胚matureembryo幼穗immaturespike胚性愈伤组织发生率embryogeniccallusgeneratingrate(%)78100外植体的生理年龄也影响愈伤组织器官发生的能力，如油菜植株的茎段自下而上进行培养的效果不同，下部器官形成率较低，而上部形成愈伤组织的苗分化率则较高表4油菜茎的不同节位与苗分化的关系（品种23）部位（由上而下）分化苗频率％每块苗数173.34.0253.92.1322.20.547.10.150.00.060.00.070.00.0外植体苗龄对蚕豆愈伤组织诱导的影响花叶如意不同外植体对愈伤组织诱导的影响红豆杉不同外植体的愈伤组织诱导情况3、愈伤组织在培养基上保持的时间愈伤组织经长期继代培养，大多数物种基因型的愈伤组织再生能力降低，且受遗传因素控制，依不同基因型而异，但也有例外，有的基因型的植株再生往往在愈伤组织经多次继代后而产生4、培养基类型依培养基配方中含盐量多少可将目前培养基分为