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第四章疫苗的制备与检定技术本章主要内容：第01节疫苗概述第02节疫苗制造基本程序第03节生物制品菌毒种的筛选与管理第04节灭活剂、免疫佐剂和保护剂第01节疫苗概述一、疫苗的概念疫苗（Vaccine）：通过注射或粘膜途径接种，可以诱导机体产生特异性体液和/或细胞免疫反应，从而使机体获得保护的生物制品。二、疫苗的基本成分1.抗原：疫苗的核心成分。须具有免疫原性和反应原性。抗原应具备的条件：异源性，一定的理化性质，特异性。可作为抗原的物质：病毒、细菌、寄生虫或其组成成分、类毒素、蛋白质、多肽和DNA（核酸疫苗）。2.佐剂：能够提高抗原刺激机体产生免疫应答反应的物质。同时应无毒、安全，在非冷藏条件下稳定。3.防腐剂：目前，灭活疫苗一般应添加防腐剂，如硫柳汞、叠氮钠等。研制无防腐剂疫苗是未来的趋势。4.稳定剂：又称保护剂，保持抗原结构的稳定或活微生物的活力。如冻干疫苗中的乳糖、明胶、山梨醇等。5.灭活剂及其他相关成分：甲醛是常用灭活剂。其他成分如缓冲液等。三、对疫苗的基本要求1.具有很强的免疫原性（有效性）；2.安全性；3.稳定性。四、疫苗的种类根据制备疫苗的材料，可将疫苗分为：细菌性疫苗（菌苗）、病毒性疫苗（疫苗）、寄生虫疫苗（虫苗）和类毒素疫苗。根据病毒的活性，可将疫苗分为灭活疫苗（死苗）和弱毒疫苗（活苗）。根据疫苗成分的数量，可将疫苗分为单苗和多联（价）活苗。根据疫苗有效成分的形式，可将疫苗分为全病毒疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗。根据病毒性疫苗的制备工艺、有效成分及发展过程，可将疫苗分为以下6种：（一）同源组织脏器苗（二）细胞（鸡胚）培养疫苗（三）亚单位或合成肽疫苗（四）基因工程疫苗（五）遗传重组疫苗（六）DNA疫苗（一）同源组织脏器苗将发病末期或康复动物的组织或/和体液+适量缓冲溶液，高速匀浆，4℃高速（6000～8000rpm）离心15～30min后，取上清，经灭活处理后制成的疫苗。可用于同一种动物相同疾病的预防。优点：在病原未分离成功前，可快速制成疫苗。主要用于动物疫病的紧急预防接种。缺点：可能混有其他未灭活的不明病原微生物。故绝不用于人，在动物领域的使用亦越来越少。（二）细胞（鸡胚）培养疫苗将检定合格的病毒毒种接种到传代细胞、原代细胞或鸡胚中，经3～5日培养增殖后，获得高效价病毒原液，经不同方式的处理，制成的疫苗。如果是弱毒，可不经任何处理，经检定合格后，制备成弱毒疫苗。主要在动物领域中使用。如果是强毒，则需经病毒灭活处理，加入一定量的适当免疫佐剂，混匀。经检定合格后，制备成灭活疫苗。主要在动物领域中使用。如果将病毒灭活后再进行提取纯化处理，获得高纯度的病毒抗原，则可制备成精制疫苗。主要用于人。细胞培养技术的成功是疫苗发展的助推器！（三）亚单位或合成肽疫苗由病毒粒子中提取出来的衣壳蛋白的单一成分—主要保护性抗原，或人工合成的病毒衣壳蛋白的某一部分—多肽，制成的疫苗。该种疫苗的研制，得益于免疫学理论和技术、分子生物学理论、基因工程技术和化学合成技术的发展。由于其研制成本很高，仅限于在医学领域中应用。（四）基因工程疫苗利用基因工程技术表达、纯化获得的病毒抗原成分，制成的疫苗。例如：乙肝亚单位疫苗。（五）遗传重组疫苗利用遗传重组技术，将不同（血清型、毒力、热敏性等）的病毒进行重组，获得稳定的重组体，用该重组体制成的疫苗。例如，流感重组活疫苗。（六）DNA疫苗DNA疫苗是一种新兴的疫苗,它在转染细胞后合成的目的蛋白能有效的诱导机体产生体液和细胞免疫。例如，狂犬、流感、麻疹、破伤风的DNA疫苗。DNA疫苗有容易操作、比较稳定、安全等优点，但也存在着免疫效果不够理想，需要加强免疫，疫苗用量大等缺点。还有潜在地整合突变危险，但可能性极小。可用自杀型的质粒为载体克服这种危险。第02节疫苗制造基本程序生物制品菌(毒、虫)种：1.直接用于生物制品研究、生产和检定的细菌菌种、病毒毒种以及分类地位在原虫以下的生物种；2.制备预防用生物制品、诊断制剂、治疗制剂的菌(毒、虫)种。第03节生物制品菌毒种的筛选与管理一、按毒力分类1.强毒菌(毒、虫)种：具有强致病力、免疫原性良好，常用于制造灭活疫苗和免疫血清，并用于疫苗的效力检验；2.弱毒菌(毒、虫)种：对动物无致病性、但具有一定免疫原性，用于制备弱毒疫苗。二、按作用分类菌(毒、虫)种的分类方式：1.生产用菌(毒、虫)种：直接用于生产疫苗、血清等生物制品的菌毒虫种。2.检定用菌(毒、虫)种：用于检定生物制品效力的菌毒虫种，如攻毒用强毒；检定诊断血清交叉反应的菌毒虫种。3.工具用菌(毒、虫)种：只作为工具用的菌毒虫种，如表达特异性抗原的工程菌，大肠杆菌、酵母菌等。4.标准或参考菌(毒、虫)种：不直接用于生产，而是在研究或遇到其它特殊问题时必要的参考菌毒虫种。菌、毒种应符合以下4个标准：1.免疫原性与反应原性优良；2.毒力应在规定范围内；3.生物学特性明显、背景清楚；4.遗传学上相对均一与稳定。选为强毒的菌、毒种应做以下工作：细菌或病毒分离、纯化和鉴定细菌或病毒的毒力测定细菌或病毒的抗原性测定细菌或病毒的稳定性测定细菌或病毒的冻干保存菌毒种的管理:三级管理模式：原始种子批、主种子批和工作种子批。原始种子批（primarySeedlot）：一定数量的已验明其来源、历史和生物学特性并经临床研究证明其安全性和免疫原性良好的病毒株（或菌株）或用于制备原疫苗的活病毒（或菌体）悬液。该悬液应加工为单一批，以确保其组成均一，并经充分检定。用于制备主种子批。主种子批（MasterSeedlot）：一定数量的来自原始种子批的病毒株（或菌株）或用于制备原疫苗的活病毒（或菌体）悬液。该悬液应加工为单一批，以确保其组成均一，并经全面检定。用于制备疫苗生产用的工作种子批。工作种子批（WorkingSeedlot）：按NCA批准的方法，从主种子批传代而得到的活病毒或细菌悬液。用于生产疫苗。第04节灭活剂、免疫佐剂和保护剂一、灭活与灭活剂灭活（inactivation）：破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性，但不损害其免疫原性，用以制备灭活疫苗。灭活方法：物理方法：加热、紫外线和射线照射化学方法：化学试剂，如甲醛，β-丙内酯等。甲醛是最常用的灭活剂。灭活剂（inactivator）：用于灭活微生物的化学试剂如甲醛溶液、烷化剂、苯酚、结晶紫、β-丙酰内脂等。(一)甲醛溶液(Formaldehydesolution)甲醛为无色气体，有强烈的刺激性，对眼、鼻黏膜和上呼吸道有刺激性。易溶于水合乙醇。其水溶液（36%～40%）称为福尔马林(Formalin)。甲醛最古典的灭活剂，但也是目前最主要的灭活剂。灭活机理：甲醛的醛基与蛋白质的氨基、羧基、羟基和巯基反应，分别形成羟甲基胺、亚甲基二醇单酯、羟甲基酚和硫代亚甲基二醇等，使病毒、细菌等微生物的蛋白质构象发生改变，从而使其失活。但对其免疫原性无明显影响。另外，甲醛还可以与核酸中的碱基（A、G和C）上的氨基反应，与核糖体蛋白的氨基反应，从而影响核酸和核糖体的功能。无囊膜的二十面体对称病毒有囊膜的二十面体对称病毒有囊膜的螺旋对称病毒甲醛与蛋白的氨基结合形成羟甲基或二羟甲基衍生物，后者与酰胺或胍基团反应导致蛋白变性。甲醛与核酸中含氨基的A、G、C反应使核酸变性。灭活用甲醛浓度：基本原则：浓度随不同微生物而异。1）需氧菌：0.1%～0.2%。2）厌氧菌：0.4%～0.5%。3）病毒：0.05%～0.4%。其他灭活条件：37℃，24～48hrs。有时灭活时间会更长，如破伤风类毒素用0.4%的甲醛，37℃需灭活21～23天。（二）烷化剂(alkylatingagent)1.AEI：N-乙酰基乙烯亚胺2.BEI：二乙烯亚胺3.GDA：缩水甘油醛烷化剂的灭活机制：1）烷化DNA分子中的G或A，引起单链断裂或双链交联，改变DNA的结构而破坏其功能。2）可与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸代谢。这类灭活剂能破坏病毒的核心，使病毒完全丧失感染力，一般不损害其衣壳蛋白，故能维持其免疫原性。石炭酸：苯的一部分被酚取代的化合物。灭活机制：使微生物的蛋白质变性，或抑制微生物的特异酶系统，使其失去活性。制备疫苗时的用量：0.3%～0.5%。（三）苯酚(phenol)（四）结晶紫(crystalviolet)一种碱性染料。灭活机制：其阳离子与微生物蛋白质带负电的羟基形成弱电性化合物，妨碍微生物的正常代谢。（五）β-丙内酯(propiolactone,β-PL)一种良好的病毒灭活剂，但具有致癌性作用机理：可能是作用于病原体的DNA和RNA，而不直接作用于蛋白，有利于维持病毒的免疫原性。1984年被选为狂犬病灭活苗的制备。筛选灭活剂的基本原则：选择合适的灭活剂，或研发更为优良的灭活剂是生物制品行业的一项重要工作。目前，甲醛最常用，N-乙酰基乙烯亚胺(AEI)和二乙烯亚胺(BEI)也被使用。筛选原则：1）病原体完全灭活：安全性好2）最大限度的保持病原体的抗原性：在消除病原体感染性的同时，维持其蛋白质天然的三维结构和抗原表位等。3）灭活步骤更为简单有效。1）灭活剂的特异性2）微生物种类与特性3）灭活剂浓度4）灭活温度5）灭活时间6）酸碱度7）有机物的存在影响灭活的因素：复习思考题：1.概念：灭活、灭活剂2.常用灭活剂的种类？3.影响灭活剂灭活的因素？二、免疫佐剂佐剂adjuvant免疫佐剂immunologicadjuvant：可以增强抗原特异性免疫应答的物质。根据使用和研究状况：常规免疫佐剂：常规免疫佐剂：铝盐类佐剂、蜂胶佐剂、油水乳剂。新型免疫佐剂：新型免疫佐剂：细胞因子、CpGDNA、基因工程减毒素、免疫刺激复合物(ISCOM)、脂质体。按物理性质生物学性质佐剂在体内的存留时间颗粒性佐剂非颗粒性佐剂微生物及其组分非微生物物质贮存型佐剂非贮存型佐剂其他分类：1.铝盐类2.油水乳剂3.蜂胶4.免疫刺激复合物5.脂质体6.其它颗粒性佐剂：非颗粒性佐剂：1）肽类2）表面活性分子类3）核酸及其衍生物类4）含硫复合物类5）细胞因子类6）碳水化合物高分子7）脂质分子类8）其它1.铝盐类佐剂2.蜂胶佐剂3.油水乳剂（一）常规免疫佐剂常规佐剂1：铝盐类佐剂1）氢氧化铝胶：铝胶。2）明矾：硫酸铝钾制成10%溶液，高压灭菌；调菌液pH至8±0.1，加入明矾液1~2%，充分混匀。3）磷酸三钙：在疫苗中加入氯化钙和磷酸氢二钠，使在疫苗中化合成磷酸三钙，吸附抗原后沉淀。常规佐剂2：蜂胶(propolis)蜜蜂采自柳树、杨树、栗树和其它植物幼芽分泌的树脂，并混入蜜蜂上颚腺分泌物，以及蜂蜡、花粉、其它一些有机和无机物的一种天然物质。是一种天然的免疫增强剂。常规佐剂3：油水乳剂佐剂由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂，是制备兽用灭活疫苗时广泛运用的另一种佐剂。免疫刺激复合物细胞因子类CpGDNA（二）新型免疫佐剂免疫刺激复合物：Immunostimulatingcomplex,ISCOM由抗原物质与QuilA、胆固醇按1:1:1混合后结合而成的一种具有较高免疫活性的脂质小泡。ISCOM直径为40nm，每个ISCOM约含10~12分子的蛋白质。ISCOM的最初报道者是瑞典的Morein(1984)，QuilA是从皂树皮提取的一种糖苷。细胞因子类佐剂：•由机体的免疫细胞(单核/巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)及相关细胞(血管内皮细胞、表皮细胞、成纤维细胞等)合成和分泌的一类高活性、多功能的蛋白质多肽分子。随着合成和重组抗原的日渐增多，应进一步强调合适的佐剂的作用，以确保疫苗的最大活性以及对所有接种者的保护。用细胞因子作为佐剂，已成为科学家的研究热点。主要包括白细胞介素-2、白细胞介素-1、白细胞介素-12、γ-干扰素等。CpGDNA：1.CpGDNA：以非甲基化CpG(胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸)基序(motif)为核心的DNA序列2.CpGODN：用化学方法合成的含CpG基序的寡聚脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)复习思考题：1.概念：佐剂2.免疫佐剂的类型？3.佐剂能加强免疫反应的机理是什么？4.举出3种常规免疫佐