第三章-生物制品的制备

第三章生物制品的制备（Preparation）第一节一般生物制品的制备方法(Preparationofgeneralbio-preparate)一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法（Selection、pretreatmentandpreservationofrawmaterialofbiopreparate）（1）原料选择原料的选择原则：①有效成分含量高，新鲜；②原料来源丰富，产地较近；③原料中杂质含量少；④原料成本低等。原料的选择注意事项：①植物原料生长的季节性；②微生物原料的对数期；③动物原料的年龄与性别。（2）原料的预处理与保存：①动物原料：采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。②植物原料：要择时采集并就地去除不用的部分，保鲜处理；③微生物原料：要及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。原料的保存方法主要有：①冷冻法。该方法适用于所有生物原料。常用-40℃速冻。②有机溶剂脱水法。常用的有机溶剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。③防腐剂保鲜。常用乙醇、苯酚等。该法适用于液体原料，如发酵液、提取液等。二、生物制品的提取（extraction）(1)生物组织与细胞的破碎（obtrudeoftissueandcell）：生物制品大部分存在于生物组织或细胞中，要提高提取率，破碎过程是非常重要的。常用的破碎方法：①磨切法，该法属于机械破碎方法，设备有组织捣碎机、胶体磨、匀浆器、匀质机、球磨机、乳钵等。②压力法，有加压与减压两种，常用的法兰西压釜使用效果良好。③反复冻融法，设备简便，活性保持好，但用时较长。④超声波振荡破碎法，该方法破碎效果较好，但由于局部发热，对活性有损失。⑤自溶法或酶解法，用得较少。（2）提取（extraction）生物组织与细胞破碎后要立即进行提取。提取时，首先要根据活性物质的性质，①选择提取试剂。提取试剂主要有：水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂（如氯仿、丙酮等）。②考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取时间。③注意提取的温度、pH、变性剂等因素。三、分离纯化的基本过程四、分离纯化的基本技术(1)分离纯化技术应满足的要求①技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；②选择性要好，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数；③收率要高；④两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整；⑤分离纯化过程要快，能够满足高生产率的需求。2.细胞破碎与固液分离（1）细胞收集常用离心分离的方法；膜过滤法也逐渐得到广泛应用。（2）细胞破碎有机械破碎法和非机械破碎法。（3）固液分离分离细胞碎片是比较困难的，可以用离心、膜过滤或双水相分配的方法，使细胞碎片分配在一相（通常为下相）而分离，同时也起部分纯化作用。3.目的产物的分离纯化分离纯化主要依赖色谱分离方法。色谱技术是下游精制阶段的常用手段，该法优点是具有多种多样的分离机制，设备简单，便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应。色谱技术分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、高压液相色谱等。第二节各类生物制品的分离纯化方法蛋白质核酸糖类脂类氨基酸一、蛋白质类制品的分离纯化方法（Isolationanddepurationofproteinproduction）包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有：(1)沉淀法（precipitation）：蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质。常用的有盐析法（saltingout）、有机溶剂沉淀法（organicsolventprecipitation）、等电点沉淀法（isoelectricprecipitation）、与靶物质结合沉淀法（如抗体—抗原）（targetbandingprecipitation）等。(2)按分子大小分离的方法：有超滤法（ultrafiltration）和透折法（dialysis）（即膜分离方法）、凝胶层析法（gelchromatography）、超速离心法（ultracentrifugation）等。其中膜分离法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和脱盐。(3)按分子所带电荷进行分离的方法氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解质。它们具有等电点，在离开等电点的pH时便会带正或负电荷。例如某蛋白质等电点为7.0，当溶液pH为4.0时，分子则带有正电荷。由于具有该性质，利用带电性质进行分离是极其有效的方法。利用电学性质进行分离的方法有离子交换柱层析法（ion-exchangechromatography）、电泳法（electrophoresis）、等电聚焦法（isoelectricfocusing）等。（4）亲和层析法（affinitychromatography）大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶与底物（或抑制剂）、抗原与抗体、激素与受体等，它们之间有特异的亲合作用，利用该性质设计的特异层析分离技术称为亲和层析。亲和层析分离专一性强，操作简便，是当前应用很广泛的分离方法之一。另外，最近出现的新方法还有疏水层析（hydrophobicinteractionchromatography）等。二、核酸类制品的分离纯化方法（Isolationanddepurationofnucleicacid）核酸类药物生产方法主要有提取法和发酵法。提取法生产DNA和RNA，先提取核酸和蛋白质复合物，再解离核酸与蛋白质，然后分离RNA与DNA。发酵法主要用于生产单核苷酸。三、糖类制品的分离纯化方法（Isolationanddepurationofsugar）由于各种糖类制品的性质和原料来源不同，没有统一规范的提取和纯化工艺。这里只介绍多糖和粘多糖的一般分离纯化方法。（1）提取方法（extraction）非降解法适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖，提取采用的溶剂是水或盐溶液。降解法（degradation）适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖（mucoitin）。如从软骨中分离提取硫酸软骨素（chondroitinsulfate），就是用碱处理进行降解。又如用酶处理法可提取与蛋白质结合的多糖。（2）分离方法（isolation）常用的分离方法是沉淀法和离子交换层析法。乙醇沉淀法（alcoholprecipitation）：是从提取液中沉淀多糖的最简易方法，也适用于分级分离。4-5倍体积的乙醇可以使任何结缔组织中的粘多糖完全沉淀。用季铵化合物也可沉淀粘多糖。粘多糖的聚阴离子能与某些阳离子表面活性剂结合成不溶于水的盐，如十六烷基三甲基铵（CTA）等。离子交换层析法（ionexchangechromatagraphy)：粘多糖的聚阴离子能够很好地被阴离子交换剂吸附和分离，如DowexI-X2（商品名）离子交换树脂、DEAE-离子交换纤维素（二乙胺乙基）等。洗脱可用NaC1溶液进行梯度洗脱。四、脂类制品的分离纯化方法（isolationanddepurationoflipoid）（1）提取方法（extraction）脂类自然状态下是以结合形式存在的。非极性脂是与其他脂质分子或蛋白质分子的疏水区相结合的。提取脂质就是要选择适当的溶剂来破坏这种结合键，将脂质溶解出来。常用的溶剂有组合溶剂，醇是其中的主要成分，此外还有氯仿、甲醇、水等。（2）纯化方法（depuration）沉淀法(precipitation)：由于不同脂质在丙酮中溶解度不同，故常用它进行沉淀。吸附层析法(adsorptionchromatography)：常用吸附剂有硅胶、氧化铝等。它是通过极性和离子力等把各种化合物结合到固体吸附剂上。洗脱一般是采用极性逐渐增大的洗脱液来进行，非极性的先流出，极性的后流出。离子交换层析法（Ionexchangechromatography）:脂质分子的存在有非解离、两性离子和酸式解离三种状态。根据它们在一定pH条件下的解离情况，选择适当的离子交换剂可将它们提纯。如TEAE—纤维素对分离脂肪酸和胆汁酸等特别有效。五、氨基酸类制品的分离纯化方法（isolationanddepurationofAa）（1）氨基酸的生产方法（productionofAa）蛋白质水解法（proteinhydrolysis）：水解法有酸水解（acidhydrolysis）、碱水解（basehydrolysis）和酶水解（enzymehydrolysis）三种。①用盐酸水解为常用方法，其优点是水解迅速、完全，产物全部是L—型氨基酸，缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸等部分被破坏。②碱水解法易产生消旋作用，较少应用。③酶水解法水解不够完全。发酵法（fermentation）：菌株经过发酵后，从培养液中提纯氨基酸。化学合成与酶促合成法化学合成法一般得到的是DL—型氨基酸，尚需要对异构体拆分；酶促合成法也是酶工程在医药工业上的应用，优点是技术工艺简单，转化率高，副产物少和易提纯等。（2）氨基酸的分离方法（isolationofAa）有沉淀法（percipitation）、吸附法（adsorption）和离子交换法（ion-exchange)。沉淀法(percipitation)：根据形成沉淀的原理不同分为两种：①是依据不同氨基酸在水中或其他溶剂中的溶解度差异进行沉淀分离。②是用特殊试剂沉淀某种氨基酸，如用邻二甲苯-4-磺酸与亮氨酸形成不溶性盐沉淀，再用氨水分解，使亮氨酸游离出来。吸附法(adsorption)：这是利用吸附剂根据氨基酸吸附力的差异进行氨基酸分离的方法。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分离就是利用活性炭对其吸附的原理。离子交换法（ion-exchange)：氨基酸是两性电解质，在一定pH条件下，不同氨基酸带电性质及解离状态是不相同的，因此在离子交换剂上被吸附的强度不同。常用的离子交换剂为强酸型阳离子交换树脂，洗脱主要用pH梯度洗脱。第二节人体来源生物制品制备实例（Exampleofbio-preparationapplicationtohuman）一、人血浆白蛋白制剂的制备（preparationofhumanbloodplasmaalbumin）（1）结构和性质（structureandcharacter）人血是一种红色混浊的、具有一定腥味与粘滞性的液体。用适当的抗凝剂除去其中的有形成分（如红血球）而得到淡黄色、半透明的液体叫血浆。血浆中除含有大量的水分以外，还含有血浆蛋白等溶质。白蛋白（albumin）又称清蛋白，白蛋白是血浆蛋白中含量最高（3.8～4.8%）、分子量最小、分子数最多的一类蛋白质。白蛋白对治疗因失血、创伤、烧伤等引起的休克，脑水肿和大脑损伤性所致的脑压增高，防止低蛋白血症，肝硬化或者由肾病引起的水肿与腹水等严重疾病具有良好疗效。白蛋白为单链分子，由584个氨基酸残基组成，N端为天门冬氨酸，C端为亮氨酸，分子量为6.6×104，在离子强度为0.15时，pI为4.7，易溶于水，在60%硫酸铵饱和度以上沉淀。对酸较稳定，受热变性。从人体中分离的白蛋白有两种：一种是从健康人血浆中分离制得的人血清白蛋白，另一种是从健康产妇胎盘中分离制得的胎盘白蛋白。血（无抗凝剂）→自然凝固→分离出血清（无纤维蛋白酶原、凝血因子等）血+混合抗凝剂草酸铵草酸钾离心上清血浆总蛋白：6.2-7.9%白蛋白：3.8-4.8%水：90-92%（现常用肝素、柠檬酸钠）（2）工艺路线（图3-1）图3-1白蛋白生产工艺路线利凡诺,NaHCO3pH8.6,离心分离络合物蒸馏水，NaCl，HCl弱酸性，40℃，离心离心液浓缩超滤浓缩液灭活病毒65℃，1h；60℃，10h热处理液除菌除菌过滤白蛋白液干燥冷冻干燥白蛋白去杂蛋白人血浆（%）（3）工艺要点①络合对于络合所要求的pH值，可以略高些，这样，白蛋白络合完全，络合物形成一个相当硬的块，倾倒上清液方便，损失少。但不能太高，以防络合血浆中的其它蛋白，影响解离与白蛋白制剂的纯度。若pH值偏低，络合不完全，络合物松软，