植物生理指标--最新实验原理与方法

11、氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）2、POD（过氧化物酶）活性的测定——愈创木酚法3、CAT(过氧化氢酶)测定4、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定5、谷胧甘肽还原酶(GR)的活力测定:6、O2-产生速率的测定7、过氧化氢(H2O2)含量的测定——碘化钾分光光度法8、丙二醛（MDA）含量的测定9、还原型抗坏血酸（ASA）和脱氢抗坏血酸（DHA）的测定10、谷胱甘肽还原酶测定11、MDAR(单脱氢抗坏血酸还原酶)活性的测定12、可溶性总糖的测定13、考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量14、叶绿素含量的测定15、石蜡制片的制作16、激素Indole-3-AceticAcid（IAA）、AbscisicAcid（ABA）、GA3和ZA的测定17、cDNA扩增片段长度多态性技术（cDNA-AFLP）18、3′/5′RACE扩增基因全长19、根系活力的测定（TTC法）1一氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）【实验原理】SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应：由于超氧自由基（O2.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还原生成二甲月替，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1.分光光度计2.台式离心机（二）材料1.磷酸氢二钠2.磷酸二氢钠3.甲硫氨酸4.EDTA-Na25.核黄素6.氮蓝四唑(NBT)7.陶瓷小研钵8.4-5ml离心管9.10ml玻璃试管（三）试剂1.0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：2A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml，B母液(NaH2PO4)21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。2.14.5mM甲硫氨酸溶液：称取1.0818gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至500ml。3.3mMEDTA-Na2溶液：称取0.1117gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。4.60μM核黄素溶液：称取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。5.2.25mM氮蓝四唑(NBT)溶液：称取0.092gNBT用PBS定容至50ml，避光保存。【实验步骤】1.酶液提取称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml（0.6ml、0.5ml、0.5ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清夜即为SOD粗提液。2.酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取配好的Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液6ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后充分摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和40μl（可视情况调整）酶液于指形管中此即反应管；同时做两支对照管，其中1支试管加3ml反应混合液和40μlPBS（不加酶液）作为最大光还原管，另1支加3ml反应混合液和40μlPBS同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。（3）将试管置于光照培养箱中在4000lux光照25℃下反应20min；（4）反应结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在560nm下的吸光度（OD560）3.计算结果已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活单位（U），按下式计算活性n=[(ODmax-OD560)/ODmax]/2SOD总活性＝[(Ack-AE)×V]/（1/2Ack×W×Vt）SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/gFW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时的酶液用量（ml）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。【注意事项】1.酶液提取须在4℃下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降；2.植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或3pvpp等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。3.NBT反应液配好后过滤除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分摇匀然后使用。4.加反应液时最好在暗光下进行；5.核黄素产生O2.，NBT还原为篮甲潛都与光照密切相关，照光强度和时间要严格控制。光照培养箱内壁裱糊锡箔纸，使箱内均匀光照约达40μmolm-2s-1，同时使照光时间一样，选择试管尽量一致，照光结束后测一个拿一个（最好晚上做）（温度高时照光时间缩短，温度低时延长）；6.测定活性时加入的酶量，以能抑制反应的50％为佳。（一个酶单位相当于引起反应液达到半抑制时酶的用量，即以能抑制反应50％的酶量为一个SOD酶活性单位。）（反应液中加酶液与PBS调零差异不大，反应液调零与其它两个则有一定差异。李合生方法：2支CK管均以缓冲液代替酶液。）【参考文献】BeauchampC,FridovichI.Superoxidedismutase.Improvedassaysandanassayapplicabletoacrylamidegel.AnalBiochem,1971,44:276-287.ZhouW,ZhaoD,LinX.Effectsofwaterloggingonnitrogenaccumulationandalleviationofwaterloggingdamagebyapplicationofnitrogenfertilizerandmixtalolinwinterrape(BrassicanapesL.).J.PlantGrowthRegul,1997,16,47-53.二愈创木酚过氧化物酶（POD）活性的测定----愈创木酚法【实验原理】在过氧化物酶催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm下吸光值变化测定过氧化物酶活性。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1.分光光度计2.台式离心机（二）材料1.磷酸氢二钠2.磷酸二氢钠3.2-甲氧基酚4.30％H2O245.陶瓷小研钵6.2ml离心管（三）试剂1.0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)的配制：分别取A母液(Na2HPO4)12.3ml和B母液(NaH2PO4)87.7ml混匀即为100mlPBS(0.2M，pH6.0)；【实验步骤】1.酶液提取称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml（0.6ml、0.5ml、0.5ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清夜即为酶粗提液。2.酶活性测定（1）反应混合液的配制：取50mlPBS（pH6.0，0.2M）缓冲液于烧杯中，加入28μl愈创木酚（2-甲氧基酚）于磁力搅拌器上加热搅拌，直至溶解愈创木酚溶解，待溶液冷却后加入19μl30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。（2）酶活性测定：取3ml反应液并加入40μl酶液后测定OD470值在40秒的变化。以PBS代替酶液为对照调零，3.计算结果以每minOD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。，按下式计算活性POD活性=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）(u/gFW)ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml）。【注意事项】1.反应液配制时由于愈创木酚难溶，应加热一段时间。加入H2O2前注意溶液冷却，防止H2O2的挥发。2.由于该反应迅速，加入酶液要立即进行吸光值的测定。参考文献J.L.Muñoz-Muñoz,F.García-Molina,P.A.García-Ruiz,E.Arribas,J.Tudela,F.García-Cánovas,J.N.Rodríguez-López,Enzymaticandchemicaloxidationoftrihydroxylatedphenols,FoodChemistry,Volume113,Issue2,15March2009,Pages435-444F.Quintanilla-Guerrero,M.A.Duarte-Vázquez,B.E.García-Almendarez,R.Tinoco,R.Vazquez-Duhalt,C.Regalado,Polyethyleneglycolimprovesphenolremovalbyimmobilizedturnipperoxidase,BioresourceTechnology,Volume99,Issue18,December2008,Pages8605-86115三CAT(过氧化氢酶)的测定【实验原理】过氧化氢酶(Catalase,CAT),是一种广泛存在于生物组织中的氧化还原酶，它能催化H2O2分解为水和氧气,清除组织中的过氧化氢。H2O2在240nm处有一个吸收高峰,其吸光度与H2O2的含量成正比,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。单位时间内吸收的差值就是过氧化氢酶的活性。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1.分光光度计2.台式离心机（二）材料植物叶片等植物材料（三）试剂10.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4)228.75ml和B母液(NaH2PO4)146.25ml混合后用蒸馏水定容至500ml。20.3％H2O2:吸取0.5ml30％的H2O2，用PBS(pH7.0)定容至50ml。【实验步骤】1.酶液提取称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml（0.6ml、0.5ml、0.5ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清夜即为CAT粗提液。2酶活性测定（1）反应混合液的配制：取100mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.1546ml30%的H2O2摇匀即可。（2）取2.9ml反应液加入0.1ml酶液，以PBS为对照调零，测定OD240值在40s内的变化。3结果计算：酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。CAT=[ΔA240×Vt]/（W×Vs×0.01×t）(u/gFW)ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml）。【注意事项】6H2O2易分解，应现用现配。【参考文献】AebiH(1984)Catalaseinv