(自创)基因工程的基本操作程序

1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。一、目的基因的获取(一)、目的基因主要是______________________,也可以是一些具有调控作用的因子。编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?请阅读P9第一和二两段1、从基因文库获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、人工合成目的基因已知序列未知序列一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取1.基因文库：概念见P92.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类种类基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库3.基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。4.获取目的基因的根据：见课本P9注意：基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库5.基因文库的构建方法之一（1）直接分离法(鸟枪法)某种生物的单链mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶反转录法：cDNA的合成流程图解5.基因文库的构建方法之基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果DNA双链复制（碱基互补配对）四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子模板DNA95℃PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点72℃第2轮结束1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，理论上至少需要几个引物？2×（2n-1）(n为循环次数)（24-1）×2=30（三）人工合成•已知其序列•已知其mRNA的序列•已知其翻译产物的氨基酸序列基因比较小，核苷酸序列又已知。DNA合成仪目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)反转录合成1）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：人工合成的目的基因的具体方法–从基因文库中获取–利用PCR技术扩增–利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资料:复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因它们各自有什么作用？步骤二：基因表达载体的构建——核心调节基因操纵基因结构基因RNA聚合酶半乳糖苷酶酶酶RNA聚合酶启动子RNA聚合酶启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。为什么要构建基因表达载体呢？目的：所需物质：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。基因工程技术路线（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞（1）农杆菌转化法①特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。③转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色体DNA表达新性状转入农杆菌基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（2）基因枪法适用于单子叶植物（3）花粉通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。适用于被子植物胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊2.将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微注射仪注射到受精卵中）（2）操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到输卵管或子宫受精卵发育新性状动物常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA3.将目的基因导入微生物细胞思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？用Ca2＋处理，增加细菌细胞壁的通透性受体生物植物动物微生物受体细胞导入方法受精卵体细胞受精卵细胞/个体农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术用Ca2+处理成感受态细胞采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（）A.将毒素蛋白注射到受精卵中B.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养C.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵D.将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中四、目的基因的检测与鉴定•检测:–是否插入目的基因–是否转录–是否翻译•鉴定:–分子水平鉴定–个体生物学水平鉴定1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因①首先取出转基因生物的基因组DNA；（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:②将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。（一）检测基因探针：是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。DNA分子杂交示意图采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。（二）鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等①方法:分子杂交方法:抗原-抗体杂交②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质出现杂交带脱分化组织培养若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？没有抗虫基因的棉植株有抗虫基因的棉植株棉铃虫虫没有死虫被杀死没有表达目的基因表达类型步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交（DNA和DNA之间）是否成功显示出杂交带第二步目的基因是否转录出mRNA分子杂交技术（DNA和mRNA之间）是否成功显示出杂交带第三步目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交是否成功显示出杂交带个体水平鉴定包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。目的基因的表达和检测提示：①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解聚成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。