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单核增生李斯特氏菌检测概述张惠媛2005年6月内容•简介李斯特氏菌属•单核增生李斯特氏菌生物学特性•流行病学•致病性•实验室危害及其预防•检测程序•快速检测方法李斯特氏菌属李斯特氏菌属（Listeria）普遍存在于环境中，最新的分类学研究表明，其分为六个种：单核增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）伊氏李斯特氏菌（Listeriaivanovii）无害李斯特氏菌（Listeriainnocua）斯氏李斯特氏菌（Listeriaseeligeri）威氏李斯特氏菌（Listeriawelshimeri）格氏李斯特氏菌（Listeriagrayi）在李斯特氏菌属的六个种中，只有两种致病菌：单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中最有检测意义的是单核增生李斯特氏菌。生物学特性---菌体形态及染色特征•革兰氏阳性；•小的、类似球形杆菌，0.4~0.5×0.5~2µm，在有些培养基中稍弯，两端钝圆，单个、成短链、细胞彼此连成V形，或成群的细胞沿长轴方向平行排列，在较老的或生长不良的培养物中，可能形成丝状；•20-25℃以4根周生鞭毛运动，在37℃只有较少的鞭毛或1根鞭毛；•无芽孢、无荚膜。生物学特性---培养特性•兼性厌氧；•在20--25℃培养有动力，穿刺培养2-5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。•生长温度范围为2-42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培养温度为35--37℃。•pH范围pH4.4-pH9.6。生物学特性---培养特性•在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。•在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。•在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)琼脂上，用45°角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。生物学特性---生化反应•触酶阳性，氧化酶阴性。•能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。•不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。生物学特性---血清型•根据菌体（O）抗原和鞭毛(H)抗原，将单增李氏菌分成13个血清型，分别是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e和“7”。•致病菌株的血清型一般为1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后两型尤多。生物学特性---抵抗力•该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和食品中能长期存活；•对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min可杀死此菌；•湿热灭菌（121℃，至少15min）和干热灭菌（160-170℃，至少1hr）可杀灭该菌，对紫外线和γ射线敏感；•该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素（已产生抗性）、氨基糖苷类、氯霉素均敏感。流行病学•分布：广泛存在于自然界中，土壤、地表水、污水、废水、青储饲料、动植物及其食品中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播•寄主范围：哺乳动物、鸟类、鱼类、甲壳类和昆虫流行病学•据报道，有1-10%的人类肠道中存在单核增生李斯特氏菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。•相关食品：鲜奶、巴氏消毒奶、奶酪（尤其是软奶酪）、冰激凌、生的蔬菜、发酵过的生肉制作的香肠、生的和加工过的禽肉、各种生的肉类、生的和烟熏的鱼肉。约有85-90%的病例是由被污染的食品引起的。1996年至1999年，因单核增生李斯特氏菌回收的食品种类（来源：USDA及FDA报告）致病性及其治疗•该病的临床表现，健康成人个体出现轻微类似流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自然流产或死婴、脑膜炎、败血症直至死亡。•由该菌造成的脑膜炎的致死率可高达70%，败血症的死亡率达50%，围产期或新生儿感染的死亡率超过80%，怀孕期妇女的感染，母亲通常能存活下来。•抗生素治疗，用青霉素或氨苄青霉素注射给药，或与氨基糖苷类抗生素一起用药。感染人群•感染剂量未知，但与该菌的毒力和易感人群的年龄、免疫状态有关。•易感者：孕妇/胎儿—围产期和新生儿的感染；接受皮质激素、抗癌剂治疗、器官移植治疗、艾滋病患者等免疫缺损者；癌症病人—尤其是白血病的患者；不太常见的报道—糖尿病、肝硬化、哮喘和溃疡性结肠炎的患者；年纪较大的人；没有免疫缺陷的健康的人，食用污染该菌尤其是大量污染该菌的食品后，也有患病的危险。致病机理•单增李氏菌的抗原结构与毒力无关，它的致病性与毒力机理如下：1、寄生物介导的细胞内增生，使它附着及进入肠细胞与巨噬细胞；2、抗活化的巨噬细胞，单增李氏菌有细菌性过氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬细胞内的过氧物（为杀菌的毒性游离基团）分解；3、溶血素，即李氏杆菌素O，可以从培养物上清液中获得，有α和β两种，为毒力因子。实验室危害•不是一种普遍的与实验室相关的传染病，目前只有少数有报道的案例发生；•直接摄取是最普遍的一种感染方式，除此之外，暴露在该菌高浓度的气溶胶中，也可通过眼睛和破损的皮肤、粘膜进入体内造成感染。注意事项•生物安全2级，操作时应有相应的防污染设施，在进行可能产生气溶胶的操作时，应在生物安全柜内完成；•在直接接触有感染性的材料时，必须穿着实验服，戴手套和护目镜；•怀孕的妇女应避免接触传染物。操作要求•溅洒：使气溶胶沉降，穿着防护服装，用纸巾轻轻覆盖溅洒处，加入1%次氯酸钠溶液，由周边向中心加，在清理之前要留充足的接触时间（30min）；•废弃：在废弃前应先采取净化措施，高压蒸汽灭菌、化学消毒、焚烧等；•储存：在有适当标记的密封容器内储存。检测程序---增菌目前常用的单核增生李斯特氏菌检测增菌肉汤主要有半量Fraser肉汤、Fraser肉汤（FB）、UVM（ModifiedUniversityofVermontbroth，也叫UVM1）、LEB（Listeriaenrichmentbroth）和BLEB（bufferedListeriaenrichmentbroth）半量Fraser肉汤和Fraser肉汤•具有选择性和区别性。•加入柠檬酸铁铵和七叶灵，起到区别的作用。李斯特氏菌可以水解七叶灵，与培养基中的铁离子反应，使培养基变黑，可直观的从培养液的颜色就可以判断是否有单核李斯特氏菌的生长。•氯化锂、吖啶黄和萘啶酮酸作为选择性因子。•半量Fraser肉汤与Fraser肉汤所用的添加剂一样半量Fraser肉汤：萘啶酮酸10mg/L，吖啶黄12.5mg/LFraser肉汤：萘啶酮酸20mg/L，吖啶黄的25mg/LUVM•UVM只有选择性没有区别性•加入萘啶酮酸和盐酸吖啶黄，作为选择性因子。虽然其中含有七叶灵，但是没有添加柠檬酸铁铵，不能发生黑色的颜色反应。LEB和BLEB•只有选择性没有区别性•LEB是在TSB-YE的基础上加入盐酸吖啶黄、萘啶酮酸和放线菌酮等选择性因子；加入的丙酮酸钠，有助于受损细胞的恢复；不含七叶灵和柠檬酸铁铵，无颜色反应•BLEB是在LEB基础上加入缓冲体系：磷酸二氢钾和磷酸氢二钠检测程序---分离•分离培养基有：OXA、PALCOM、LPM、MOX等，但首选仍然是OXA。分离原理主要是基于李斯特氏菌具有β－D－葡萄糖苷酶的活性，能水解培养基中的七叶灵，产生七叶苷，与铁离子产生颜色反应而，使菌落为棕褐色，并带有褐色晕圈，而致病性和非致病性李斯特氏菌病都能发生这种反应•还有一些选择性显色培养基，如BCM、ALOA、CHROMagarlisteria、Rapid’L.mono等，其原理主要是检测由毒力基因编码的溶血素，而此种溶血素只存在于单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌中，因而可以很好的将此两种菌同李斯特属的其他种分开。OXA平板单核增生李斯特氏菌ATCC1911748h，35℃培养OXA平板无害李斯特氏菌ATCC3309048h，35℃培养检测程序---鉴定•蓝色菌落检验（Henryillumination）•典型运动：相差显微镜，轻微旋转或翻跟头动力试验：7天，伞形生长•过氧化氢酶试验：阳性•革兰氏染色：阳性短杆菌•溶血试验：穿刺接种血平板•硝酸盐还原试验：5天，阴性•糖发酵试验：葡萄糖、麦芽糖和七叶灵，李斯特菌属反应均为阳性，除格氏李斯特甘露醇阴性，李斯特其他种甘露醇阴性，木糖和鼠李糖最有检测意义动力试验血平板单核增生李斯特氏菌ATCC1911736h，35℃培养血平板无害李斯特氏菌ATCC3309036h，35℃培养血平板伊氏李斯特氏菌ATCC1911924h，35℃培养单核增生李斯特氏菌检测流程25g样品+225mlBLEB基础（加入丙酮酸钠）加入萘啶酮酸、盐酸吖锭黄、放线菌酮30℃4hr划线接种OXA平板30℃24hr和48hr科玛嘉李氏菌显色培养基TSA-YE分纯35℃24hr-48hr35℃24hr过氧化氢酶试验、革兰氏染色、溶血试验、糖发酵试验（木糖、鼠李糖）APIListeria35℃24-48hr报告结果35℃18-24hr方法名称一次增菌二次增菌分离鉴定快速方法SN0184-1993加工MBP30℃，18-24hEB30℃，24/48hMMA/OXA（35℃，24-48h）蓝色菌落；典型运动；过氧化氢酶；革兰氏染色；溶血试验；尿素酶试验；硝酸盐还原；MR-VP；三糖铁；糖发酵；动力试验；协同溶血*；血清学检验*；小鼠毒力试验*无未加工EB（30℃，24/48h）GB/T4789.30-2003EB（30±1℃，48h）MMA（30±1℃，24-48h）蓝色菌落；三糖铁；动力试验；染色镜检（革兰氏染色、典型运动）；生化特性（溶血反应、硝酸盐还原、尿素酶、MR-VP、糖发酵）；小鼠毒力试验；协同溶血无LB1（30±1℃，24h）LB2（30±1℃，24h）FDABLEB+Phy（30℃，4h）BLEB+Phy+三种抑菌剂（30℃，20/44h）OXA/PALOM/MOX/LPM+七叶灵+Fe3+推荐BCM/ALOA/RapidL'mono/CHROMagarListeria蓝色菌落*；典型运动或动力试验；过氧化氢酶；革兰氏染色；溶血试验；硝酸盐还原*；糖发酵；协同溶血；血清学检验；小鼠毒力试验*筛选、鉴定都可以使用快速方法USDAUVM（30±2℃，22±2h）FB（35±2℃，26-48±2h）MOX（35±2℃，26-48±2h）初步鉴定：纯菌菌落形态；典型运动；生化鉴定：MICRO-ID®Listeria或Api®Listeria或BAM等方法中的传统生化反应；协同溶血遗传鉴定：核糖体RNA检测；PFGE*筛选用的快速方法必须经过确认后才可使用鉴定中用到MICRO-ID®、Api®、GenProbeAccuProbe®、GENE-TRAK®各官方方法比较各官方方法比较方法名称一次增菌二次增菌分离鉴定快速方法CFIAMFHPB-30LEB（UVM）（30℃，24/48h）MFB（35℃，24-48h）OXA+LPM或MOX或PALCOM典型运动或动力试验；溶血试验；甘露醇；木糖；鼠李糖；快速鉴定试剂盒*；过氧化氢酶*；革兰氏染色*；协同溶血*；血清学试验*作为鉴定的可选步骤，允许使用快速方法，如Vitek或API、MicroIDListeria、ListeraAccuprobe™ISO11290-1:1996（E）半量Fraser肉汤（30℃，24±2h）Fraser肉汤（35或37