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第八章基因工程•基因工程(geneticengineering)、基因克隆、DNA重组、DNA克隆、分子克隆•克隆（clone）无性繁殖–应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，或其表达产物。•基因克隆示意图载体DNA(限制性内切酶切开)目的基因＋宿主细胞＋重组体已转化的宿主细胞阳性克隆株繁殖表达基因工程大事记•1973Cohen第一例成功的克隆实验•1978Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物•1982第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用•1985第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼•1993基因工程西红柿在美国上市•1997英国罗斯林研究所多莉羊•1999.9中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%•2000.6.26科学家公布人类基因组工作草图•2001.2.11公布人类基因组基本信息•生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程*胰岛素*人生长激素*干扰素*白细胞介素2*粒细胞集落刺激因子*粒细胞巨噬细胞集落刺激因子*红细胞生成素EPO*组织纤溶酶原激活剂*生长激素*促生长素*抗血友病因子Ⅷ*脱氧核糖核酸酶*葡糖脑苷脂酶*鼠单克隆抗体自然界的基因转移和重组•基因重组(geneticrecombination)——整段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交换,并能在新的位置上复制,转录和翻译•自然界的基因转移和重组是无目的•基因工程有目的•结合作用–质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）•转化作用transformation–通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程转导作用transduction•病毒、噬菌体介导–溶菌途径；溶原菌途径裂解溶原基因工程•工具酶•载体•重组DNA技术的基本过程•真核细胞转染•克隆基因的表达工具酶限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记末端转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基常用的工具酶：一把特殊的剪刀—限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖•1953年，Arber研究噬菌体与细菌（A、B）的关系。•发现100-200个子代噬菌体中，只有1个可感染B，即其他的噬菌体在B中受到限制，唯有这一个受到修饰（甲基化）后感染成功。•细菌B：在缺甲硫氨酸的培养基中，细菌死亡。•原因：细菌无法对自己的DNA进行修饰。•假设：限制性内切酶与修饰酶。•1967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和切割序列，认为它由5-6个碱基组成•原因：限制性酶将T7DNA切成平均长度为1000碱基的片段。•识别和切割序列：中心对称的回文结构。•限制性酶：HindⅡ•Nathans：用限制性酶切割猴子SV40DNA，DNA测序。C-A-Pu-Py-T-GG-T-Py-Pu-A-C5'3'5'3'限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)•识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键•分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型•命名：–EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序)•识别和切割位点–回文结构4～6bp–出现两种末端*粘性末端粘端*平头末端平端•同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点•同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端粘性末端与平头末端EcoRⅠGAATTCCTTAAG5′3′5′3′5′GCTTAAAATTCG3′3′5′粘性末端SmaⅠCCCGGGGGGCCC5′3′3′5′5′CCCGGGGGGCCC3′3′5′平头末端修饰酶•DNA聚合酶Ⅰ•逆转录酶(reversetranscriptase)•T4DNA连接酶(T4ligase)•碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)•末端脱氧核苷酰转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)•TaqDNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)的活性•5′至3′的聚合活性–5′→3′方向•核酸外切酶活性–5′→3′外切酶活性–3′→5′外切酶活性•polⅠ经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段–大片段（Klenow片段）：聚合活性、3′→5′外切活性常用的工具酶核酸外切酶活性•3′→5′外切酶活性•5′→3′外切酶活性5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性′′′′5335末端脱氧核苷酰转移酶(TDT)载体vector•DNA，能在宿主细胞中进行自我复制和表达•克隆载体、表达载体–原核载体：质粒(pBR322,pUC…）噬菌体（λ，M13）等–真核载体：动物病毒载体pLXSN等常用的克隆载体•质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子–理想的质粒*拷贝数多;*两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lacZ)筛选标志*多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiplecloningsites,MCS)四环素抗性基因氨苄青霉素抗性基因OriPstⅠSalⅠPvuⅡAvaⅠBamHⅠHindⅢEcoRⅠpBR322(ampr)(terr)常用的克隆载体•λ噬菌体(λphage)–基因组分三个区域：左侧区、中间区（非必需区）、右侧区–DNA，替换型载体，外源DNA：9~23kb–常用：EMBL系列、λgt系列、charon系列•粘性质粒(cosmid)：λDNA的cos区+质粒，双链环状DNA，克隆容量：40~50kb•M13噬菌体–最大优点：产生单链DNAcos:cohesive-endsite特点：RFDNA:replicationalformDNA优点：表达载体(expressingvector)•特点：带表达构件—转录和翻译所需的DNA序列•大肠杆菌表达载体：含启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号–启动子：trp-lac(tac)启动子、λ噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子–核糖体结合位点(ribosome-bindingsite,RBS)：起始密码子(ATG)和SD序列–转录终止序列哺乳动物表达载体•真核表达元件：启动子/增强子—克隆位点—终止信号和加poly(A)信号重组DNA技术的基本过程•目的基因的制备•载体的选择和制备•DNA分子的体外连接•将外源DNA导入宿主细胞•目的基因的筛选和鉴定目的基因(targetDNA)的制备•目的基因（外源基因）•制备基因组DNA-基因文库(genomiclibrary)—存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组DNA的集合•制备cDNA-cDNA文库(cDNAlibrary)•制备用于表达的基因片段：PCR技术、化学合成RNA模板杂化双链单链DNA双链DNA反转录酶RNaseH碱水解DNA聚合酶整合S1核酸酶细胞内复制试管内合成反转录酶反转录酶•载体的选择和制备：λ噬菌体、粘性质粒、pUC系列、M13噬菌体•DNA分子的体外连接（DNA连接酶）–粘性末端连接连接效率高*相同酶切末端–平端连接连接效率低–人工接头(linker)法–同聚物接尾法同聚物接尾法目的基因载体DNA+dGTP+dCTPPolyGPolyC3′3′3′3′将外源DNA导入宿主细胞•基因工程菌HB101,JM109•转化(transformation)–制备感受态细胞冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态•感染(infaction)–转导(transduction)：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程•转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。目的基因的筛选和鉴定(screening/selection)•遗传学方法–插入灭活法(insertioninactivation):抗药性标志选择–标志补救表达产物与营养缺陷互补*α-互补蓝白斑筛选•免疫学方法•分子杂交探针–原位杂交•PCR•限制性酶切图谱IPTG;X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)bp—1534—994—695—515—377—237ABCM克隆基因的表达•载体有转录、翻译的元件；密码子通用•原核表达体系–原核表达载体的标准*合适的筛选标志*强启动子*翻译控制序列*多克隆位点•融合蛋白（fusionprotein,包涵体）–表达的蛋白质或多肽的N末端由原核DNA编码，C末断由克隆的真核DNA编目。•大肠杆菌表达体系的不足–缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA–缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化–融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性–很难表达大量的可溶性蛋白真核表达体系•转染方法–磷酸钙沉淀–DEAE葡聚糖介导转染–电穿孔–脂质体转染；人造膜–显微注射•筛选标志tk-NeorG418•瞬时转染目的基因不整合进宿主基因组•稳定转染目的基因整合进宿主基因组tk-细胞突变株筛选转染细胞•胸苷激酶（tk）–TTP：从头合成（氨甲喋呤阻断），补救合成–HAT选择（H：次黄嘌呤；A：氨甲喋呤；T：胸苷）–tk+：生长–tk-+带tk基因的质粒：生长药物筛选转染细胞•neor–新霉素：细菌抗生素，干扰原核生物蛋白质合成–G418：干扰原核、真核生物–neo：磷酸转移酶，使G418失活–neo与目的基因连锁,转染目的基因的定点诱变及其应用•基因定点诱变技术•基因定点诱变技术的应用