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1、结合图，判断下列有关基因工程的工具酶功能的叙述，正确的是()。A．切断a处的酶为限制性核酸内切酶B．连接a处的酶为DNA聚合酶C．切断b处的酶为限制性核酸内切酶D．切断c处的为限制性核酸内切酶cADNA连接酶解旋酶DNA水解酶1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取二、基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取主要是编码蛋白质的结构基因2、获取方法：1、目的基因:1）从基因文库中获取目的基因1）从基因文库中获取目的基因：⑴基因文库:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(genelibrary)⑵分类：①基因组文库:包含了一种生物所有的基因的基因文库。构建方法：限制酶切法②部分基因文库（如cDNA文库):包含了一种生物的一部分基因的基因文库。构建方法：逆转录法限制酶切法（鸟枪法或散弹射击法）用限制酶切断成许多片段某生物体内全部DNA许多DNA片段受体菌群体1、从基因文库中获取目的基因限制酶与运载体连接导入基因组文库某种生物某个时期的mRNAcDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入部分基因文库（cDNA文库）外显子内含子与RNA聚合酶结合位点编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点编码区原核生物基因真核生物基因RNA聚合酶AGGTCACGTCGTCCAGTGCAGCAGGUCACGUCG一个典型的原核细胞基因结构示意图非编码区非编码区编码区TCCAGTAGGTCAAGATCTmRNA多肽链与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345编码区下游非编码区非编码区编码区转录mRNA前体加工成熟mRNA翻译肽链一个典型的真核细胞基因结构示意图一、目的基因的获取主要是编码蛋白质的结构基因2、获取方法：1、目的基因:1）从基因文库中获取目的基因2）利用PCR技术扩增目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因①概念：聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。③条件：_______________________、_______________、___________(做启动子)、___________.②原理：__________DNA复制模板DNA四种脱氧核苷酸一对引物热稳定DNA聚合酶利用PCR技术扩增循环变性退火延伸⑤方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）指数2n利用PCR技术扩增目的基因④过程：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增⑥结果：①：加热至90～95℃，使DNA解旋；②：冷却到55～60℃，2个引物分别与DNA单链结合；③：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶开始互补链的合成。氢键断裂与体内DNA复制的区别：①：不需要解旋酶；②：需加入引物（前提：已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物）③：需热稳定DNA聚合酶(Taq酶)；与体内DNA复制的相同点：(1)模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板(2)原料：均为四种脱氧核苷酸(3)酶：均需DNA聚合酶(4)引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸一、目的基因的获取主要是编码蛋白质的结构基因2、获取方法：1、目的基因:3）化学方法人工合成——DNA合成仪1）从基因文库中获取目的基因2）利用PCR技术扩增目的基因3、人工合成法在基因较小，核苷酸序列已知的前提下，可以利用DNA合成仪人工合成蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化学合成推测推测思考：化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？二.基因表达载体的构建1、载体构建目的：2、基因表达载体的组成启动子+目的基因+终止子+标记基因-----------核心（P11）同时使目的基因能够表达和发挥作用。使目的基因在受体细胞内稳定存在，并且可以遗传给下一代，表达载体启动子：终止子：①位置:首端②本质:DNA③功能:有与RNA聚合酶结合的位点，能驱动转录①位置:尾端②本质:能终止转录3、基因表达载体的构建过程•特别提醒该过程把三种工具(两种工具酶、一种载体)全用上了，是最核心、最关键的一步，在体外进行。思考：如果用同一种限制性内切酶，处理质粒和目的基因，并将产物放在一起用连接酶连接它们，最后可以产生多少种环状的DNA分子？你认为它们是怎么组成的？三、将目的基因导入受体细胞2、将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。1、常用的受体细胞：动物、植物、微生物。（1）.将目的基因导入植物细胞1）农杆菌转化法三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞——最常用方法、经济有效3、转化的概念：目的基因进入受体细胞内并在受体细胞中维持稳定和表达的过程。4、转化的方法：1）农杆菌转化法⑴适用范围：双子叶植物和裸子植物；(2)原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。三、目的基因导入受体细胞构建基因表达载体转入农杆菌植物细胞导入稳定维持和表达③过程：（1）.将目的基因导入植物细胞1）农杆菌转化法2）基因枪法3）花粉管通道法三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞——最常用方法、经济有效——单子叶植物常用、准确但成本高——我国独创、简便经济3、转化的概念：目的基因进入受体细胞内并在受体细胞中维持稳定和表达的过程。4、转化的方法：（2）.将目的基因导入动物细胞-----显微注射技术2）将目的基因导入动物细胞1.方法：显微注射技术2.受体细胞：受精卵3.程序:目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物（1）.将目的基因导入植物细胞1）农杆菌转化法2）基因枪法3）花粉管通道法三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（2）.将目的基因导入动物细胞（3）.将目的基因导入微生物细胞-----Ca2+处理-----显微注射技术——最常用方法、经济有效——单子叶植物常用、准确但成本高——我国独创、简便经济3、转化的概念：目的基因进入受体细胞内并在受体细胞中维持稳定和表达的过程。4、转化的方法：3)将目的基因导入微生物细胞①微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少②常用菌：大肠杆菌③常用法：Ca2+处理获得感受态细胞④过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞感受态细胞吸收DNA表达载体与感受态细胞混合方法受体细胞其他处理或特点植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法体细胞、受精卵植物组织培养（脱分化和再分化）动物细胞显微注射法受精卵动物细胞培养早期胚胎培养胚胎移植或胚胎分割移植微生物细胞Ca2+处理法（感受态细胞）原核细胞繁殖快，多为单细胞，遗传物质少（农杆菌Ti质粒的T-DNA的特点：即能进入受体细胞，又能与受体细胞的染色体DNA整合）双子叶、裸子四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？1真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。2目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？不一定，需要检测四、目的基因的检测与鉴定1、分子水平检测—2、个体水平鉴定—①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等DNA分子杂交DNA-RNA分子杂交抗原—抗体杂交转基因生物的DNA含目的基因的DNA单链为探针15N15N14N14N基因探针：放射性同位素等标记的DNA分子方法——DNA分子杂交技术变性变性DNA分子杂交示意图•用DNA分子杂交技术可鉴定两个物种之间的亲缘关系的远近。将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。如果杂合部位多，则亲缘关系近，反之则远。1、鉴定——分子水平的鉴定变性方法——分子杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了mRNA探针15N15N转基因生物的mRNA14N14N1、鉴定——分子水平的鉴定提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质出现杂交带脱分化组织培养2、鉴定——个体水平的鉴定抗虫、抗病接种实验，活性比较实验例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。四、目的基因的检测与鉴定1、分子水平检测—2、个体水平鉴定—①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等DNA分子杂交DNA-RNA分子杂交抗原—抗体杂交考法方法过程导入检测外源基因是否与受体细胞的染色体整合DNA分子杂交用放射性同位素或荧光分子标记的目的基因的单链做探针，与转基因生物的基因组DNA杂交，观察是否出现杂交带。表达检测是否转录分子杂交用放射性同位素或荧光分子标记的目的基因的单链做探针，与转基因生物细胞中的mRNA杂交，观察是否出现杂交带。表达检测是否翻译抗原-抗体杂交从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原－抗体杂交，观察是否出现反应。个体水平检测比较简单的方法抗虫或抗病实验如，转基因抗虫植物是否出现抗虫性状，让害虫食用转基因植物的叶片，观察其是否死亡。基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定1、从基因文库中获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、化学方法人工合成目的基因+启动子+终止子+标记基因农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、Ca2+处理法DNA分子杂交技术DNA-RNA分子杂交技术抗原—抗体杂交技术个体水平鉴定分子检测巩固练习:1.人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗生素抗性基因,该抗性基因的主要作用是()A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性B.有利于对目的基因是否导入进行检测C.增加质粒分子的分子量D.便于与外源基因连接2.在遗传工程技术中,限制性内切酶主要用于()A.目的基因的提取和导入B.目的基因的提取和检测C.目的基因与载体的结合和导入D.目的基因的提取与载体结合BD3.在遗传工程技术中,下列何种目的基因一般以直接分离的方法获得()A.人的胰岛素基因B.蚕的蚕丝蛋白基因C.芽孢杆菌的抗虫基因D.菜豆储藏蛋白基因4.1976年,美国的科学家首次将人的生长抑制素释放因子的基因转移到大肠杆菌,并获得了表达,此文中的表达是指该基因在大肠杆菌()A.能进行DNA复制B.能传递给细菌后代C.能合成生长抑制素释放因子D.能合成人的生长素CC5.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的,在基因操作的基本步骤中,不进行减基互补配对的步骤是()A.人工合成目的基因B.目的基因与载体结合C.将目的基因导入受体细胞D.目的基因的检测和表达C原核生物基因表达的调控ＲＰＯlacZlacYlacA调节基因启动子操纵基因结构基因RNA聚合酶信使RNA转录翻译阻抑物乳糖转录半乳糖苷酶酶酶1、下列四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是()A．①②B．②③C．③④D．②④D练习3、已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据图示判断下列操作正确的是（）A．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割B．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割C．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割D．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割C实验现象实验推论在含青霉素培养基上生长情况在含四环素培养基上生长情况导入质粒情况，及目的基因插入位置目的基因插入位置ABCD未导入质粒的普通的大肠杆菌不能生长不能生长导入外源基因的重组质粒的大肠杆菌，且位点在a能生长不能生长导入外源基因的重组质粒的大肠杆菌，且位点在c不能生长能生长导入外源基因