12基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞操作过程目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取(一)、目的基因主要是______________________编码蛋白质的基因请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成请阅读P8、9第一和二两段一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取1.基因文库：概念见P92.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类种类基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库3.基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。4.获取目的基因的根据：见课本P9（一）基因文库的构建（1）基因组文库的构建提取某生物全部DNA用适当限制酶切割许多DNA片段与载体连接导入受体菌群该生物基因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文库的构建——mRNA反转录形成与载体连接导入受体菌群mRNA逆转录酶杂交双链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链DNA(cDNA)该生物cDNA文库1、概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。聚合酶链式反应体外特定DNA片段2、原理：DNA复制二、利用PCR技术扩增目的基因四种脱氧核苷酸(dNTP)一对引物：热稳定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(需含有目的基因)4、条件：一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物3、前提：温度控制IMN变性复性延伸5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G变性复性延伸1、变性(90---95度)：目的基因DNA受热变性，解链为单链；2.复性（55---60）：引物与两条单链通过碱基互补配对原则结合；3.延伸（70---75）：在DNA聚合酶（Taq酶）作用下，从5′端→3′端进行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ5、扩增过程利用PCR技术扩增目的基因PCR技术扩增过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，断裂，形成_______b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，从引物的______________________延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链随堂闯关随堂闯关5′端→3′端（三）通过DNA合成仪用化学方法人工合成DNA合成仪蛋白质的氨基酸顺序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推测推测合成当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA1.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。——核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同(二)基因表达载体的构建科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资料:基因表达载体的组成：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因知识点一：1.原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落)①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：知识点一：2.真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点等。原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码