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1.2基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取1、目的基因主要是指______________________编码蛋白质的结构基因例子?2、获取目的基因的常用方法有哪些?（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成(一)从基因文库中获取目的基因1.什么是基因文库？种类？如何构建？一、目的基因的获取基因组文库cDNA文库含有一种生物的全部基因含有一种生物的部分基因种类：基因组文库cDNA文库基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子与RNA聚合酶结合位点：编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区原核细胞基因结构①不编码蛋白质。②调控遗传信息表达,上游有启动子，下游有终止子真核细胞基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：调控，上游有启动子，下游有终止子非编码序列：包括非编码区和内含子编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续不连续编码区非编码(一)从基因文库中获取目的基因1.什么是基因文库？种类？如何构建？2.怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？一、目的基因的获取依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性。1．有关目的基因的获取和基因文库的理解，不正确的是()A．目的基因可以从自然界中分离，也可以人工合成B．目的基因主要指编码蛋白质的结构基因C．基因文库就是基因组文库D．cDNA文库只含有某种生物的一部分基因2．下列属于获取目的基因方法的是①利用mRNA反转录形成②从基因文库中获取③从受体细胞中提取④利用PCR技术扩增⑤利用DNA转录⑥人工合成A．①②③⑤B．①②⑤⑥C．①②③④D．①②④⑥DC(二）利用PCR技术扩增目的基因PCR技术—多聚酶链式反应•原理：•前提：•条件：DNA双链复制一段已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物热稳定DNA聚合酶(Taq酶）DNA的两条链为模板温度控制一、目的基因的获取复习：1、目的基因？2、获取目的基因的常用方法有哪些?3、什么是基因文库？种类？5、原核细胞与真核细胞的基因结构？6、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？4、基因组文库？cDNA文库？变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至55～60℃部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链退火变性延伸(二）利用PCR技术扩增目的基因(三)通过DNA合成仪用化学的方法直接人工合成一、目的基因的获取前提：基因比较小，核苷酸序列已知。是获取目的基因的最方便方法1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法B、基因组文库法C、cDNA文库法D、多聚酶链式反应2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④D．②③AD3.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是C4、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是A.540个B.8100个C.17280个D.7560个B5、目的基因主要是指_______________的结构基因。获得目的基因的常见方法有三种：（1）从基因文库中获取目的基因，根据基因的_________序列，基因在________上的位置，基因的________产物mRNA，基因的_______产物蛋白质等获取目的基因。（2）利用PCR技术扩增目的基因，该技术是一项在________完成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的________序列，以便于合成_________。（3）如果基因较小且核苷酸序列已知，可以通过____________方法。编码蛋白质核苷酸染色体转录表达体外核苷酸引物人工合成二、基因表达载体的构建（核心）(1)用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。(2)用_____________切断目的基因，使其产生_________________。(3)将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同1、目的：2、过程：基因表达载体的组成：a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是A．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码D1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括A．目的基因B．启动子C．终止子D．标记基因ABCD三、将目的基因导入受体细胞转化——方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是A．结构简单、操作方便B．繁殖速度快C．遗传物质含量少、简单D．性状稳定、变异少2、基因工程常用的受体细胞有①大肠杆菌②枯草杆菌③支原体④动植物细胞A．①②③④B．①②③C．②③④D．①②④BD3.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是①将毒素蛋白质注射到棉受精卵中②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中③将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中④将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养A．①②B．②③C．③④D．①④C4.下列属于基因工程中导入目的基因方法的是①农杆菌转化法②基因枪法③花粉管道法④显微注射法⑤胚胎移植⑥DNA分子杂交法A．①②③④⑤⑥B．①②③④⑤C．①②③④D．①③④⑤⑥C四、目的基因的检测与鉴定检测—鉴定—①是否插入了目的基因②是否转录出了mRNA③是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交mRNA与DNA分子杂交抗原-抗体杂交个体生物学水平的鉴定知识延伸——DNA分子杂交技术标记待检测1.比较载体与基因表达载体的区别。2.切割DNA获取目的基因和切割载体时一般情况下为什么要选用同一种限制性核酸内切酶？经过重组过程后会形成几种DNA分子？3.分析为什么动物的受体细胞不能为体细胞？4.讨论大肠杆菌细胞转化时为什么要用Ca2+处理细胞。5.目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内稳定保存的实质是什么？6.基因探针的实质是什么？7.若使农杆菌也能感染单子叶植物，应如何操作？8.基因工程操作的四个步骤中，有哪几个步骤涉及到碱基互补配对？小结:基因工程的基本操作程序1.获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成2.构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射技术、感受态细胞4.目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定1.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是A．提高受体细胞在自然环境中的耐药性B．有利于对目的基因是否导入进行检测C．增加质粒分子的分子量D．便于与外源基因连接2.有关基因工程的叙述正确的是A．限制酶只在获得目的基因时才用B．重组质粒的形成是在细胞内完成的C．质粒都可作为运载体D．蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料BD3.哪项不是基因表达载体的组成部分A.启动子B.终止密码子C.标记基因D.目的基因4.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法A．基因枪法B．显微注射法C.农杆菌转化法D．花粉管通道法BB5、有关基因工程的叙述中，错误的是A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B、限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、人工合成目的基因不用限制性内切酶A6.将ada(腺苷酸脱氨酶基因)通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是A.每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒B.每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点C.每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个adaD.每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子C7.农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的应用。下图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题：(1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是____，利用农杆菌能在自然条件下感染植物的特点，能实现__________。具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T-DNA片段，它具有可转移到受体细胞并整合到受体细胞的____上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到____(部位)即可。(2)根据T-DNA这一转移特点，猜测该DNA片段上可能含有控制_____________________(酶)合成的基因。(3)图中c过程中，能促进农杆菌移向植物细胞的物质是_____________类化合物。(4)植物基因工程中将目的基因导入受体细胞的方法除了农杆菌转化法之外，还可采取________________。(至少写出两种)单子叶植物目的基因导入到植物细胞染色体DNAT-DNA片段(内部)DNA连接酶、限制酶酚基因枪法、花粉管通道法1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法三、将目的基因导入受体细胞花粉管通道法1、将目的基因导入植物细胞的方法：三、将目的基因导入受体细胞基因枪法2、将目的基因导入动物细胞显微注射法目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵移植到输卵管或子宫新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子处理物质：常用菌：微生物作受体细胞原因：Ca2+处理大肠杆菌繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：思考与探究：2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA)。（2）将cDNA前接上在大肠杆