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1、基因工程至少需要哪三种工具？2、这三种工具分别起什么作用？温故知新：1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定问题1一：目的基因的获取如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。1.目的基因主要是指___________________编码蛋白质的基因什么是目的基因2、也可以是具有调控作用的因子获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、人工合成目的基因已知序列未知序列(一)从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库1.基因文库概念2.基因文库类型基因组文库部分基因文库（包含一种生物的所有基因）（包含一种生物的一部分基因）基因组文库与部分基因文库的关系怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。4.cDNA文库的构建提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA单链DNA双链cDNA片段重组载体与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。cDNA合成过程是：第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。问题2为什么用生物发育某个时期的mRNA反转录得的DNA只有这种生物的部分基因？某个时期的发育是基因选择性表达的结果两种基因文库的主要区别如下表（课本P10）文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少部分基因全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以总结1、概念：PCR全称为________________，是一项在生物____复制_____________的核酸合成技术3、条件：2、原理：__________多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制(二)利用PCR技术扩增目的基因模板（目的基因）原料(脱氧核苷酸)引物（一小段单链DNA）DNA聚合酶（耐高温）温度控制4、操作前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。6、结果。5、扩增形式：指数形式（2n）在短时间内大量扩增目的基因7、过程：a、变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物开始进行碱基互补配对，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链(二)利用PCR技术扩增目的基因动画演示（三）通过DNA合成仪直接合成目的基因DNA合成仪推测推测合成前提：基因比较小、核苷酸序列已知蛋白质的氨基酸顺序mRNA核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因问题43、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用_________________获取目的基因的三种方法应用1、如果知道目的基因两端的核苷酸序列，而且基因比较大，可采用____________2、如果知道目的基因的序列，而且基因比较小，可采用________________PCR技术扩增化学方法人工合成从基因文库获取的方法二：基因表达载体的构建——基因工程的核心1目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因等启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，RNA聚合酶识别和结合的部位终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来3.基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶处理两个切口四个黏性末端DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端跟踪训练(2012年江苏无锡高二检测)如图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法错误的是()A．基因工程的核心步骤是基因表达载体构建B．任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别C．图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因B三、将目的基因导入受体细胞1转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。3目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法基因枪法花粉通道法显微注射法Ca2＋处理法受体细胞一般是体细胞受精卵一般原核细胞4、目的基因导入受体细胞的方法为什么动物细胞要用受精卵做受体细胞？全能性受限制（1）农杆菌转化法①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。三、目的基因导入受体细胞构建基因表达载体转入农杆菌植物细胞导入稳定维持和表达③过程：（2）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞①操作方法：利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。②钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.6～4um。③适用：单子叶植物（3）花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞①操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞②特点:十分简便经济。③例：转基因抗虫棉（我国）（4）、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物（5）、将目的基因导入微生物细胞①微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少②常用菌：大肠杆菌③常用法：Ca2+处理获得感受态细胞（改变细胞壁的通透性）④过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞感受态细胞吸收DNA表达载体与感受态细胞混合从细胞器的功能上分析，若通过基因工程生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？【提示】不可以，糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。问题3导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少，且有的会摄入载体-载体，目的基因-目的基因类型目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？不一定，需要检测问题4问题5练习采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是()①将毒素蛋白注射到棉受精卵中②将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中③将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导人细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养④将编码毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵A、①②B、②③C、③④D、①④C——检查是否成功分子水平个体水平：①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交抗原抗体杂交四、目的基因的检测与鉴定转基因生物的DNA探针15N15N14N14N（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因基因探针：放射性同位素等标记的含有目的基因DNA片段方法——DNA分子杂交技术变性变性变性方法——分子杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了mRNA探针15N15N转基因生物的mRNA14N14N提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质出现杂交带脱分化组织培养（4）除上述分子检测外，有时还需进行个体生物学水平的鉴定：如抗性特性