MALDI-TOF-MS的原理和应用-1226

周春喜博士布鲁克·道尔顿公司应用工程师基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的原理和应用简介MALDI-TOF质谱的基本原理蛋白鉴定和蛋白质组分析定量蛋白质组学细菌鉴定血清多肽谱分析分子成像内容提要什么是质谱仪？+++样品离子源质量分析器生物质谱仪的离子源与质量分析器离子源ElectroSprayIonization(ESI)Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization(MALDI)质量分析器TimeofFlight(TOF)IonTrap(IT)Quadrapoles(Q)FourierTransformIonCyclotronResonance(FT-ICR)生物质谱仪的类型离子源MALDIESI质量分析器TOFIonTrap(IT)Quadrupoles(Q)FTMS+质谱仪的类型MALDI-TOF;MALDI-TOF/TOFESI-TOFESI-Qq-TOFESI-IonTrapESI-tripleQuadrupolesESI(orMALDIor….)FTMSESI(orMALDIor….)Q-qFTMS………E=U·z=1/2mv2和t=L/VE：离子在加速电场获得的动能;U：加速电场电压z：离子所带电荷;m：离子质量v：离子飞行速度;L：飞行管道长度t：离子飞行时间;c：常数质量分析范围：500Da---100KDaMALDI-TOF质谱的原理t=c·m/zMALDI-TOF-MS线性模式检测SampleplateAnalytemoleculesinmatrixAccelerationgridsDrifttubeIondetectorMassspectrumVacuumsystemVacuumlock几秒钟即可得到结果triggerdiodelaservariableattenuator250l/sturbo250l/sturbolinearMALDITOF质谱的组成一级质谱质谱图提供的信息2373382472764779538231596318269144409556*E_coli_OS\0_E1\1\1SLin01234x10Intens.[a.u.]20003000400050006000700080009000m/z分子量(定性信息)峰强度(定量信息)400006000080000100000m/z2004006008001000120014001600180020002200240026002800a.i.多肽和蛋白质分子量的测定BovineSerumAlbumin多肽的序列分析IntensityM/ZParentIonPeptideChainAr,HeorLaser571131289714787+7918699GlyLeuorIleLysProPheSer+P*TrpValDaughterIonGlyLeuorIleLysProPheSer+P*TrpVal肽链的裂解方式及碎片离子的命名H2NHNNHHNOHR1OR2OR3OOR4a1b1c1a2b2c2a3b3c3z1y1x1z2y2x2z3y3x3P.RoepstorffandJ.Fohlman,Biomed.MassSpectrom.11,601(1984).K.Biemann,MethodsEnzymol.193,886(1990).MALDITOF-TOF串联质谱的原理质谱图离子检测器离子反射器母离子选择器MALDI离子源LIFT子离子加速器LID高灵敏度，分析浓度至低fmol软电离方式，主要产生单电荷离子，谱图易解析能容忍一定的盐浓度：PBS20mM线性TOF分析器可测定大分子的分子量反射式TOF具有高分辨率,可进行PMF分析通过串联质谱可进行序列分析MALDI-TOF质谱的优点MALDI-TOF质谱的基本原理蛋白鉴定和蛋白质组分析定量蛋白质组学细菌鉴定血清多肽谱分析内容提要400006000080000100000m/z2004006008001000120014001600180020002200240026002800a.i.多肽和蛋白质分子量的测定BovineSerumAlbuminBSA的肽质量指纹图(PMF)1567.6702044.925927.4501724.7501283.6482492.1221305.6401362.5973135.3202313.9462676.101BSAdigest\0_B3\1\1SRef2000400060008000Intens.[a.u.]7501000125015001750200022502500275030003250m/zBSA的氨基酸序列Mascot检索结果多肽的二级质谱图931.5131046.555354.201400.216110.064517.260647.358756.390263.14701000200030004000500060001002003004005006007008009001000m/z1479.770175.1141180.719980.468571.407668.4361093.528892.436300.187500.4061366.7951282.499BSAdigest\0_G11\1\1479.7712.LIFT\1SRef01234x10Intens.[a.u.]200400600800100012001400m/z多肽的序列匹配931.5131046.555354.201400.216110.064517.260647.358756.390263.14701000200030004000500060001002003004005006007008009001000m/zm/z2004006008001000120014000246810121416182022242628Abs.Int.*1000bEYGFQNALIVRyRVILANQFGYEGLy1b2y2b3y3b4y4b5y5b6y6b7y7b8y8b9y9b10y10b11y11b12y12b13y13Mascot检索结果蛋白质组分析的常用技术路线基于二维电泳分离的蛋白质鉴定LC-MALDI:基于液相色谱分离的蛋白质鉴定ProteineerfcMALDIfractioncollectorLCAnchorChipTOF/TOFMALDI-TOF质谱的基本原理蛋白鉴定和蛋白质组分析定量蛋白质组学细菌鉴定血清多肽谱分析内容提要二维电泳分离后,确定差异蛋白,再进行鉴定NormalStageCancerStageSubtractionDisplayPeptideMassFingerprint(PMF)蛋白质的搜库鉴定MascotSearchResultsProteinIDMALDI-TOF质谱的基本原理蛋白鉴定和蛋白质组分析定量蛋白质组学细菌鉴定血清多肽谱分析分子成像内容提要如何快速鉴别不同种类的微生物？BioTyper：微生物的鉴别与分类待检样品克隆选择样品制备质谱分析数据分析菌种鉴定?BacillusglobigiiProfilingresultsfromdifferentBacillusstrains-6000-4000-20000200040006000a.i.B.globigiiB.licheniformisB.subtilisB.thuringiensis实验流程ResultReport|DetectedSpecies|Ranking|actSc|maxSc|RelScore|PNk|PNb|PNm|RelP-Num.|I-Corr.|1000*Pro---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Spectrum#12|Ps.mendocinaDSM50017|1|3813|4271|0.89|41|10|83|0.55|0.88|438|Ps.oleovoransB396|2|1671|3450|0.48|14|8|83|0.22|0.39|41|Ps.fluoreszensB340|3|868|4186|0.21|6|7|83|0.11|0.19|4|Ps.veroniiDSM11331|4|847|4250|0.20|5|7|83|0.10|0.14|3|Ps.putidaDSM291|5|374|2821|0.13|3|3|83|0.05|0.12|1|Ps.putidaB401|6|329|2638|0.12|3|2|83|0.05|0.11|1基于谱图模式比对的细菌鉴定细菌鉴定结果的报告MALDI-TOF质谱的基本原理蛋白鉴定和蛋白质组分析定量蛋白质组学细菌鉴定血清多肽谱分析分子成像内容提要患者血清样品磁珠分离过程数据分析临床结果***疾病正常正常BindingWashingElutionMALDITOF检测血清多肽谱的分析流程可选择的磁珠类型HydrophobicInteractionMB-HIC1MB-HIC3MB-HIC8MB-HIC18ImmobilizedMetalAffinityChromatographyMB-IMAC-FeMB-IMAC-CuIonExchangeMB-WCXMB-WAX磁珠捕获低丰度蛋白的过程疾病诊断标志物的筛查正常组疾病组疾病诊断结果的报告3000400050006000m/z6080100120140160180200220240260280300320340360380a.i.核酸的分析SNP位点的检测原理位点1位点2引物2SNP位点检测的质谱图引物残余产物纯合子纯合子杂合子500070009000m/z102030405060708090100110120130140a.i.化学合成多聚物的分析Polystyrene7000!