13第十三章基因工程与基因组学

第十三章基因工程与基因组学概述廊坊师范学院生命科学学院遗传学教研室第一节基因工程一、基因工程概述二、基因工程工具酶三、基因工程的流程及相关技术四、基因工程的发展应用一、基因工程概述遗传工程（geneticengineering），也称生物工程，利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或产品，从而改良生物体的一种遗传学手段。核心是利用重组DNA技术，在分子水平上操作修饰改变生物体遗传结构。基因工程（geneengineering）：利用人工的方法把生物的遗传物质在体外进行切割、拼接和重组，获得重组DNA分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改变的过程。二、基因工程的工具酶内切核酸酶(endonuclease)DNA连接酶(ligase)DNA聚合酶（DNApolymerase）RNA聚合酶（RNApolymerase）反转录酶（reversetranscriptase）最重要的工具酶是限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease），也称限制性酶(restrictionenzyme),能识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，并在特定的位置将双连DNA分子切断。EcoRⅠ属名种名菌株名序号（一）限制性核酸内切酶常见内切酶（二）DNA连接酶连接5’－磷酸和3’－OH，形成磷酸二酯键，封闭DNA双链上的缺刻。如：E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶载体(vector)将外源DNA片段运送进宿主细胞(hostcell)进行扩增或表达的运载工具称为载体。载体也是DNA分子。常用的载体有细菌质粒、噬菌体、病毒等。经改造的黏粒(cosmid)、噬粒(phagemid)都要经过人工改造。细菌人工染色体（BAC）、酵母菌人工染色体（YAC）和人类人工染色体（HAC）λ噬菌体载体YAC（1Mb）载体的基本条件①有独立的复制原点(ori)，能独立地自我复制，而且能带动外源DNA一起复制。②具有多种限制性酶的切点，用于连接外源DNA片段。③载体上的限制酶酶切位点对于任何一种限制酶来说只能有一个。④具有一个选择标记基因。获得外源DNA片段（分）限制性内切酶切割外源DNA片段与载体（切）外源DNA片段与载体连接（接）重组DNA分子转入宿主细胞（转）重组子的筛选与鉴定（筛）目的基因的确认与分析三、基因工程的流程及相关技术（一）外源DNA片段的分离方法1.构建基因组文库分离法2.差别显示反转录PCR3.利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因1.构建基因组文库分离法用克隆载体将某种生物的基因组全部遗传信息储存于一个受体菌的群体，即构成了这种生物的基因组文库。若只储存某生物基因组的部分遗传信息，即构成部分基因组文库。•供体生物的基因组DNA切割成许多片段•将所有片段分别连接到载体上，构成一个重组DNA群体•这个群体包含全基因组的遗传信息。保存、筛选差别显示分析基本流程2.差别显示反转录PCR（DDRT-PCR）3、利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因（1）套式PCR（2）反向PCR（3）不对称PCR（4）锚定PCR（5）长程PCR（6）反转录PCR4、人工合成基因根据已知的基因序列，或根据氨基酸序列推测DNA序列将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。通过用相同的限制性核酸内切酶切割，连接形成一个重组DNA分子（二）、外源DNA片段与载体的切割和连接（三）、重组DNA转入宿主细胞1.重组DNA转入原核细胞热激转化法电穿孔转化法2.重组DNA转入真核细胞农杆菌转化法重组DNA感受态细胞冰浴混合、静置42ºC热激加入培养基扩培转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（1）热激转化法感受态细胞电转仪调为2.5kV25F脉冲控制器200-400质粒DNA混合加入培养液37℃中速震荡涂板（2）电穿孔转化法2.重组DNA转入植物细胞农杆菌介导的Ti质粒载体转化法（四）重组子的筛选与鉴定3.核酸杂交4.PCR检测5.测序6.生物学活性检测1.插入抗性失活2.蓝白斑筛选1.插入失活筛选法蓝白斑筛选重组质粒四、基因工程的发展应用1、基因工程是生物科学基础研究的重要手段2、利用转基因技术改良植物已取得很大进展并在生产上应用3、利用基因工程获得大量重组的蛋白、疫苗药物4、利用基因工程进行不同物种之间的基因传递提供了可能。转基因动植物--“生物工厂”5、疾病诊断与基因治疗6、环境保护4.利用基因工程改良动物推荐几本参考书：1、《基因工程原理与方法》，孙树汉编，人民军医出版社2、《基因工程原理》，吴乃虎编，科学出版社（侧重原理）3、《现代基因工程技术导论》，陈章良编，科学出版社（侧重应用）4、《分子克隆》(第三版)，J.Sambrooketal.科学出版社（具体的实验方法，分子生物学研究的圣经）第二节基因组学一、基因组学概述二、基因组图谱的构建三、基因组图谱的应用四、后基因组学基因组(genome)泛指一个有生命体、病毒或细胞器的全部遗传物质；在真核生物，基因组是指一套染色体（单倍体）DNA。一、基因组学概念及范畴基因组学(genomics)就是发展和应用DNA制图、测序新技术以及计算机程序，分析生命体（包括人类）全部基因组结构及功能。基因组学研究的最终目标获得生物体全部基因组序列鉴定所有基因的功能明确基因之间的相互作用关系阐明基因组的进化规律基因组学研究内容结构基因组学(structuralgenomics)功能基因组学(functionalgenomics)比较基因组学(comparativegenomics)结构基因组学（structuralgenomics）基因定位基因组作图测定核苷酸序列•遗传图（连锁图）•物理图•转录图•序列图二、基因组图谱的构建基因组计划的第一个环节：构建基因组图谱1.遗传图连锁图(linkagemap)，是指基因标志在染色体上的遗传距离，即确定各基因在基因组中的相对位置和排列顺序。遗传距离通常由基因在四分体时期染色体交换过程中分离的频率厘摩（cM）来表示。遗传标记（Geneticmarker）指可识别的等位基因。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。类型：形态标记（morphologicalmarker）细胞学标记(cytologicalmarker)生化标记(biochemicalmarker)分子标记(molecularmarker)2.、物理图以已知核苷酸序列的DNA片断（序列标签位点,STS）为“路标”，以碱基对作为基本测量单位（图距）的基因组图。DNA上两点的实际距离，即确定基因在染色体上的实际排列顺序，从而对基因定位。3、转录图以EST（expressedsequencetag，表达序列标签）为标记，根据转录顺序的位置和距离绘制的图谱。4.、序列图序列图是指整个人类基因组的核苷酸序列图，也是最详尽的物理图，既包括可转录序列，也包括非转录序列，是转录序列、调节序列和功能未知序列的总和。这是人类基因组计划最繁重、耗时最多的工作。CREDIT:JOESUTLIFFScience,Vol291:1221.FishinginaMoreEffectiveWay!人类基因组计划1990，美国国立卫生研究所和能源部投资＄30亿，启动了人类基因组计划，预计15年时间完成人类基因组全部序列的测定1996，完成标记密度为0.6cM的人类基因组遗传图谱，100kb的物理图谱2000，完成草图2001年2月，公布人类基因组图谱的修订版2002，完成测序工作国际人类基因组测序协作组（公共计划组）由6个国家、20个研究中心的2000多位科学工作者组成。国家承担的测序任务美国54%英国33%日本7%法国2.8%德国2.2%中国1%1999年9月中国获准加入人类基因组计划，负责测定人类基因组全部序列的1%，负责第3号染色体3千万核苷酸的序列测定工作。中国是继美、英、日、德、法之后第6个国际人类基因组计划参与者，也是参与这一计划的唯一发展中国家。人类基因组计划1%测序中国实验室2000年6月26日科学家公布人类基因组工作草图，标志着人类在解读自身“生命之书”的路上迈出了重要一步。HGP对人类基因面貌的新发现1.基因数量少得惊人2.人类基因组中存在“热点”和大片“荒漠”3.三分之一为“垃圾”DNA4.种族歧视毫无根据5.男性基因突变比例更高2000年是基因组之年，完成了人类基因组的工作框架图，完成了一系列模式生物和微生物的基因组序列分析。2000年12月美、英等国科学家宣布绘出拟南芥基因组的完整图谱，这是人类首次全部破译出一种植物的基因序列。三、后基因组学（postgenomics)完成一个生物体全部基因组测序后即进入功能基因组学阶段，也称后基因组阶段——详尽分析序列，描述基因组所有基因的功能，包括研究基因的表达及其调控模式。•基因的识别、鉴定、克隆•基因结构、功能及其相互关系•基因表达调控的研究（一）鉴定DNA序列中的基因ORF（二）同源搜索设计基因功能（三）实验性设计基因功能clon,knock-out,knock-in,反义RNA,RNAi（四）描述基因表达模式主要具体内容包括以下方面:功能基因组学研究策略及主要内容