第7章-生物制品

第七章生物制品第一节：生物制品概述1概念及发展沿革2生物制品的分类3制造生物制品的免疫学基础1概念及发展沿革1.1概念凡是从微生物及其代谢产物、原虫、动物毒素、人或动物的血液或组织直接加工制成，或用现代生物技术、化学方法制成，作为预防、治疗、诊断特定传染病或其他有关疾病的免疫制剂。包括各种疫苗、抗血清、抗毒素、类毒素、免疫调节剂、诊断试剂等。1.2从疫苗生产看生物制品的发展12世纪，中国开始用人痘接种预防天花，从症状轻微的天花病人身上人工接染到健康儿童，使其通过产生轻微症状的感染获得免疫力，避免天花引起的严重疾病甚至死亡。1721年，人痘接种法传入英国，英国医生琴纳注意到感染过牛痘的人不会再感染天花。经过多次实验，琴纳于1796年从一挤奶女工感染的痘疱中，取出疱浆，接种于8岁男孩的手臂上，然后让其接种天花脓疱液，结果该男孩并未染上天花，证明其对天花确实具有了免疫力。最早的弱毒活病毒疫苗。1.2从疫苗生产看生物制品的发展1798年，医学界正式承认“疫苗接种确实是一种行之有效的免疫方法”。经过一百多年的努力，1980年世界卫生组织宣布全球消灭了天花。1870年，法国科学家巴斯德发明了第一个细菌减毒活疫苗——鸡霍乱疫苗。巴斯德将此归纳为对动物接种什么细菌就可以使其不受该病菌感染的免疫接种原理，从而奠定了疫苗的理论基础。因此人们把巴斯德称为疫苗之父。1.2从疫苗生产看生物制品的发展第二代疫苗——亚基疫苗的出现，克服了第一代疫苗潜在致病性的问题。天然或重组成分为主。第三代疫苗——核酸疫苗，调动细胞免疫和体液免疫两个系统，追求最佳效果。持久，广谱，廉价。2生物制品的分类1.预防类生物制品：细菌类疫苗、病毒类疫苗、类毒素和联合疫苗。2.治疗类生物制品：⑴抗毒素及抗毒血清：由特定抗原免疫动物所得血浆制成的抗毒素或抗毒血清，如破伤风抗毒素、抗蛇毒血清等，用于治疗或被动免疫预防。⑵血液制品：如人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子（天然或重组的）、红细胞浓缩物等。⑶细胞因子⑷重组DNA产品3.诊断制品：包括体内诊断制品和体外诊断制品。4.其他制品3制造生物制品免疫学基础3.1机体的抗感染免疫1)先天性免疫（非特异性免疫）包括：①体表屏障，如皮肤粘膜屏障；②血脑屏障，防御病原微生物及其毒性产物从血流侵入脑组织；③细胞吞噬作用；④正常体液和组织中的抗菌物质。2)特异性免疫：个体在生命过程中接受抗原刺激后主动产生或被动获得的。又称获得性免疫。包括主动免疫和被动免疫。自然主动免疫：患传染病，隐性感染主动免疫人工主动免疫：接种疫苗，类毒素自然被动免疫：经胎盘，初乳特异性免疫被动免疫人工被动免疫：注射抗毒素，丙种球蛋白，细胞因子人工免疫人为的给机体输入抗原以调动机体的免疫系统，或直接输入免疫血清，使获得某种特殊抵抗力，用以预防或治疗某些疾病者，称人工免疫。人工主动免疫(artificialactiveimmunization)：是指给机体接种抗原性物质如疫苗，类毒素等，刺激机体免疫系统产生特异性免疫力的方法。3.2人工免疫人工主动免疫和人工被动免疫的比较区别点人工主动免疫人工被动免疫接种物疫苗，类毒素抗体（抗毒素，丙球）免疫出现时间慢，1-4周快，立即免疫力维持时间长（数月---数年）较短（2周---数周）用途主要用于预防多用于紧急预防和治疗人工被动免疫(artificialpassiveimmunization):是给人体注射含特异性抗体的免疫血清或细胞因子等制剂，使受者迅速获得特异性免疫力的方法。3.3人工主动免疫类生物制品疫苗（Vaccine）：细菌，病毒，螺旋体，立克次体和类毒素等抗原性生物制品统称为疫苗。安全有效实用分类1）死疫苗（deathvaccine）:选用免疫原性强的微生物标准株经大量培养后，用物理或化学方法将其杀死或灭活而制成的预防制剂。如霍乱、百日咳、伤寒、钩端螺旋体疫苗。优点：主要诱导特异性抗体产生，安全缺点：不能繁殖，需多次刺激，注射局部和全身反应严重2）减毒活疫苗（live-attenuatedVaccine）用人工定向变异或从自然界筛选得到的毒力高度减弱或基本无毒的病原微生物制成的预防制剂。优点：一次免疫即可获得长久免疫力，类似自然状态下的轻型或隐性感染。诱导体液免疫和细胞免疫。缺点：不易保存，存在回复突变的危险如卡介苗牛痘麻疹等死疫苗活疫苗制剂性状杀死的病原微生物弱毒或无毒的病原微生物接种量及次数量大，2-3次量小，1次保存及有效期易保存，较稳定，有效期一年不易保存，4度数周失效免疫效果较差，维持数月至一年较好，维持1-5年或更长3）类毒素（Toxid）细菌外毒素经0.3-0.4%甲醛处理，使其毒性减弱而保留其免疫原性。白百破：白喉类毒素+百日咳杆菌死疫苗+破伤风类毒素4）新型疫苗（1）亚单位疫苗（SubunitVaccine）是去除病原体中与激发保护性免疫无关的甚至有害的成分，保留有效免疫原成分制作的疫苗。优点：免疫效果高，不良反应少（2）合成肽疫苗(syntheticpeptidevaccine)将具有保护性免疫力的人工合成肽与适当载体结合后，再加入佐剂制成的疫苗。乙肝病毒多肽疫苗（3）基因工程疫苗DNA疫苗（DNAVaccine）是用编码病原体有效免疫原的基因与细菌质粒构建的重组体直接免疫机体，转染宿主细胞，使其表达保护性抗原，从而诱导机体产生特异性免疫的疫苗。优点：体内可持续表达，免疫效果好，维持时间长。缺点：其机制和安全性尚不完全清楚，一些问题有待解决。重组抗原疫苗(recombinantantigenvaccine)是利用DNA重组技术制备的只含保护性抗原的纯化疫苗。优点：不含活的病原体和病毒核酸，安全有效，成本低廉。目前获准使用的有乙型肝炎疫苗。重组载体疫苗(recombinantvectorvaccine)是将编码病原体有效免疫原的基因插入载体（减毒的病毒或细菌疫苗株）基因组中，接种后，随疫苗株在体内的增殖，大量所需的抗原得以表达。如果将多种病原体的有关基因插入载体，则成为可表达多种保护性抗原的多价疫苗。载体：痘苗病毒转基因植物疫苗用转基因方法，将编码有效免疫原的基因导入可食用植物细胞的基因组中，免疫原即可在植物的可食用部分稳定的表达和积累，人类和动物通过摄食达到免疫接种的目的。常用的植物有蕃茄、马铃薯、香蕉等。（一）特异性免疫治疗剂1）抗毒素利用类病毒注射动物，产生特异性抗体，经采血、分离、纯化后制成的产品。破伤风抗毒素，白喉抗毒素等。2）抗毒血清用病毒作抗原免疫动物制备的含有抗体的血清生物制品。抗蛇毒血清。3.4人工被动免疫类生物制品（二）非特异性免疫治疗剂---免疫调节剂1）转移因子2）白细胞介素3）胸腺素4）细胞毒T细胞5）干扰素第二节：疫苗研究及其研制策略疫苗的现代定义为：一切通过注射或黏膜途径接种，可以诱导机体产生针对特定致病原的特异性抗体或细胞免疫，从而使机体获得保护或消灭该致病原能力的生物制品统称为疫苗，包括蛋白质、多糖、核酸、活载体或感染因子。疫苗按生物来源一般分细菌及类毒素疫苗、病毒性疫苗、蛋白疫苗、核酸疫苗四大类。1接种目的及作用接种目的防止病原体进入机体建立抗感染免疫口服或注射疫苗激发宿主产生抗病原体的抗体暴露于病原体也不会生病进入机体的病原体被抗体失活2疫苗的种类从疫苗研制技术又可将疫苗分为传统疫苗和新型疫苗两大类。2.1传统疫苗1）疫苗（1）活疫苗：减毒活疫苗（卡介苗）（2）死疫苗（百日咳、霍乱等）2）类毒素破伤风类毒素、白喉类毒素2.2新型疫苗1）亚单位疫苗一类保留病原体中有效免疫原成分，而除去无效成分和有毒成分的疫苗。乙肝亚单位疫苗2）化学疫苗用化学方法提取病原体中有效免疫原成分制成的化学纯疫苗，比亚单位疫苗更为简单。肺炎链球菌荚膜多糖3）多肽疫苗人工合成的高免疫原性多肽片段制成的疫苗。乙型肝炎表面抗原的各种合成肽段4）基因工程疫苗利用基因工程构建重组基因序列，表达免疫原性强、无毒性的多肽制成的疫苗。乙型肝炎基因工程疫苗5）DNA疫苗用编码抗原基因制成的疫苗。流感病毒核蛋白DNA疫苗通常也习惯地将遗传重组疫苗、合成肽疫苗和抗独特型抗体疫苗包括在新型疫苗范畴。3疫苗的基本成分、性质和特征3.1疫苗的基本成分疫苗的基本成分包括抗原、佐剂、防腐剂、稳定剂、灭活剂及其他活性成分。抗原，是疫苗最主要的有效活性成分，它决定了疫苗的特异免疫原性。构成抗原的三个基本条件：异物性、特异性和一定的理化特性。可用作抗原的生物活性物质有：灭活病毒或细菌、活病毒或细菌通过实验室多次传代得到的减毒株、病毒或菌体提纯物、有效蛋白成分、类毒素、细菌多糖、合成多肽以及近年来发展DNA疫苗所用的核酸等。佐剂，能增强抗原的特异性免疫应答。目前常用的有铝佐剂和油制佐剂。3.2疫苗的基本性质包括免疫原性、安全性、稳定性。免疫原性：指疫苗接种进入机体后引起机体产生免疫应答的强度和持续时间。影响的因素包括机体的因素和疫苗的因素。从疫苗的角度看是由疫苗的抗原决定的。包括抗原的强弱、大小和稳定性以及抗原的理化性质。4疫苗制备的基本过程疫苗因种类不同，其制备方法也不相同，但总的来说，经典疫苗制备的基本过程包括：选择适宜的培养基或细胞，进行菌、毒株大量繁殖，收集培养物，提纯，半成品检定，稀释，分装，成品检定。基因工程技术使疫苗研制方法发生了革命性的变化。疫苗制备工艺流程4.1病毒类疫苗制造方法4.1.1毒种的选择和减毒毒株必须满足的条件①抗原性②典型形态，感染特定组织③人工繁殖，不产生毒素④无毒力回复⑤不被病毒感染4.1.2病毒繁殖（1）活体动物培养：牛痘牛皮下，乙脑鼠脑等。生产中已淘汰。（2）鸡胚培养。较动物管理方便。易受支原体，沙门菌污染。（3）组织培养。广泛用于病毒培养。（4）细胞培养。培养细胞的生长方式及类型贴附生长型细胞为能附着于底物（支持物）表面生长的细胞。包括非淋巴组织的细胞和许多异倍体体系的细胞都属于这一类型。当这类细胞从活体体内转移到体外培养时，必须贴附于底物才能生长。从形态上大体分为上皮细胞型和成纤维细胞型。VEGF929兔肾原代细胞悬浮生长型细胞少数细胞类型在体外培养是不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长，来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细胞均属于这一类型。这些细胞在悬浮培养中生长良好，可以是单个细胞或细小的细胞团，细胞呈圆形。细胞悬浮生长于培养基中，细胞生长空间大，具有能够提供增殖大量细胞、传代方便、易于收获的优点。SP20维持细胞培养所需的最佳条件在大规模培养动物细胞的过程中，最根本的是使细胞的培养条件达到最优化，尽可能消除或减轻环境对细胞的影响，维持细胞高存活力和高效表达，同时又要充分考虑细胞表达产物的后续纯化。①配制细胞生长最适合的培养基常用维持液和生长液Eagle、RPM1640,DEME等作为维持液，加入牛血清为生长液。②细胞培养环境影响细胞培养的主要因素有:CO2、溶氧(DO)、温度、pH值、葡萄糖、氨、乳酸、甲基乙二醛(MG)、培养基成分等。细胞培养环境最适CO2水平为4%～10%，溶氧维持在20%～50%，温度大多数在37℃，pH值在7.0～7.4之间。控制细菌污染，加入青霉素、链霉素培养时间2－4天。葡萄糖是细胞培养过程中主要的能量来源，必须维持在一定水平。4.1.3疫苗的灭活原则：充分破坏疫苗的毒力，尽量减少疫苗免疫力损失。含有大量动物组织的疫苗，0.2％－0.4％的甲醛或酚溶液；细胞培养的疫苗，0.02％-0.05％甲醛灭活的温度和时间：生物学性质和热稳定性4.1.4疫苗的纯化去除存在的动物组织，降低接种不良反应。4.1.5冻干升华，不使疫苗融解。疫苗稳定性提高1倍以上。乙型肝炎疫苗的制备乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）属嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae）。HBV的发现源于表面抗原的研究。1963年Blumberg首先在澳大利亚土著人血清中发现一种新抗原，称为