15酵母基因工程2

第十五章酵母基因工程五、酵母菌的表达系统第十五章酵母基因工程三、酵母菌的载体系统二、酵母菌的宿主系统一、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征六、利用重组酵母生产乙肝疫苗四、酵母菌的转化系统一、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征第十五章酵母基因工程1、酵母菌的分类学特征酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。一、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征2、酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（GenerallyRecognizedAsSafeGRAS）酵母菌是最简单的真核模式生物第十五章酵母基因工程二、酵母菌的宿主系统2、提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌3、抑制超糖基化作用的突变宿主菌4、减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌1、广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌第十五章酵母基因工程1、广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。2、提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型ssc1改善重组蛋白分泌钙离子依赖型的ATP酶ssc2提高重组蛋白表达转录后加工rgr1提高重组蛋白表达转录水平ose1提高重组蛋白表达转录水平ssc11改善重组蛋白分泌羧肽酶Yrho-提高重组蛋白表达转录水平突变类型生物效应作用位点3、抑制超糖基化作用的突变宿主菌能抑制超糖基化的突变类型mnn甘露糖生物合成缺陷型alg天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型och外侧糖链添加缺陷型突变类型生物效应许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。4、减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌（1）泛素、介导的蛋白质降解作用蛋白酶体LysHOOCUbiquitin76aaubiquitinligaseE3LysubiquitinligaseE3Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白（2）酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌共有四个泛素编码基因：UBI1编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达稳定期关闭UBI2编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达稳定期关闭UBI3编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）对数生长期表达稳定期关闭UBI4编码泛素五聚体对数生长期关闭稳定期表达酵母菌共有七个泛素连接酶基因：UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7（3）泛素降解途径衰减的酿酒酵母在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变株能UBI4缺陷型：正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因此UBI4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体UBA1缺陷型：UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解Ubc4-ubc5双突变型：七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效三、酵母菌的载体系统酵母菌克隆表达质粒的构建2酵母菌中的野生型质粒1第十五章酵母基因工程1.酵母菌中的野生型质粒（1）酿酒酵母中的2m环状质粒几乎所有的酿酒酵母中都含有2m双链同源重组REP1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB环状质粒，拷贝数达50至100个。IRs反向重复序列，600bp，重组FLP编码产物驱动IRs的同源重组REP编码产物控制质粒的稳定性STBREP的结合位点接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质粒类似。1.酵母菌中的野生型质粒（2）乳酸克鲁维酵母中的线状质粒乳酸克鲁维酵母中含有两种不同pGKL18.9kbDNA聚合酶毒素蛋白ab免疫蛋白g亚基的双链线状质粒pGKL1和pGKL1拷贝数为50-100个，分别携带K1K2两种能使多种酵母菌致死的毒反向重复序列素蛋白编码基因（abg），同时含有毒素蛋白抗性基因。2.酵母菌克隆表达质粒的构建（1）含有ARS的YRp质粒的构建ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。以ARS为复制子的质粒称为YRp上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。2.酵母菌克隆表达质粒的构建（2）含有CEN的YCp质粒的构建CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列将CENDNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCpYCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个（3）含有TEL的YAC质粒的构建2.酵母菌克隆表达质粒的构建（4）含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域四、酵母菌的转化系统2、转化质粒在酵母细胞中的命运1、酵母菌的转化程序3、用于转化子筛选的标记基因第十五章酵母基因工程1、酵母菌的转化程序（1）酵母菌原生质体转化法早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2%。但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%1、酵母菌的转化程序（2）碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性：吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍共转化现象极为罕见1、酵母菌的转化程序（3）酵母菌电击转化法酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较很大的负作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广，而且转化率可高达105/mgDNA。2、转化质粒在酵母细胞中的命运单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-30倍含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体这对于体内定点突变酵母基因组极为有利克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数的50-80%3、用于转化子筛选的标记基因用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基因和显性基因两大类营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难营养缺陷型的互补基因3、用于转化子筛选的标记基因显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白显性标记基因aph氨基糖苷转移酶抗G418cat氯霉素乙酰转移酶抗氯霉素dhfr二氢叶酸还原酶抗氨甲喋呤和磺胺cup1铜离子螯合物耐受铜离子suc2蔗糖转化酶耐受高浓度蔗糖ilv2乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草剂标记基因编码产物遗传表型五、酵母菌的表达系统2、外源基因在酵母菌中表达的限制因素1、酵母菌启动子的可控性3、酵母菌表达系统的选择第十五章酵母基因工程1、酵母菌启动子的可控性pho4TS-PHO5启动子：酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子因此，装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在35℃时关闭23℃诱导表达（1）温度控制型启动子PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在35℃时失活1、酵母菌启动子的可控性a–a型启动子：酿酒酵母有a和a两种单倍体，分别由MATa和MATa两个等位基因决定。a1因子决定a细胞特征表达a2因子阻遏a细胞特征表达a1-a2阻遏a细胞特征表达编码a2因子的基因突变型hmla2-102能产生a2变体，它能灭活a1，同时阻遏a型温度控制型启动子a型启动子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa型启动子受体细胞基因组重组质粒a型启动子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa型启动子a2a125℃35℃1、酵母菌启动子的可控性酿酒酵母（2）超诱导型启动子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖诱导时，GAL4高效表达，GAL1、GAL1、GAL10超高效表达GAL10Promoter的半乳糖利用酶系由GAL1GAL7和GAL10基因编码2、外源基因在酵母菌中表达的限制因素外源基因稳态mRNA的浓度外源基因mRNA的翻译活性酵母菌对密码子的偏爱性在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25个密码子编码的3、酵母菌表达系统的选择酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢（1)酿酒酵母表达系统酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。3、酵母菌表达系统的选择乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也(2)乳酸克鲁维酵母表达系统能稳定遗传40代以上。乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。3、酵母菌表达系统的选择巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生(3)巴斯德毕赤酵母表达系统长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种3、酵母菌表达系统的选择多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被(4)多型汉逊酵母表达系统克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，HARS质粒