16基因工程和蛋白质工程

第十六章基因工程与蛋白质工程第一节生物工程概述第二节基因工程第三节蛋白质工程第一节生物工程概述一、生物工程概念及研究技术二、在现代工、农、医领域中的应用一、生物工程的概念及研究技术1.基因工程——在分子水平的遗传操作技术2.细胞工程——遗传物质在细胞间的转移4.生化工程——生物工程产品的最终取得手段3.酶工程——酶的改造和设计基因工程是指在微观领域（分子水平）中，根据分子生物学和遗传学原理，设计并实施一项把一个生物体中有用的目的DNA(遗传信息)转入另一个生物体中，使后者获得新的需要的遗传性状或表达所需要的产物，最终实现该技术的商业价值。基因工程基因工程与建筑工程基因工程操作水平：DNA分子水平目的：定向改变遗传物质或获得基因产物。2、基因工程的理论基础1）物质基础——脱氧核苷酸2）结构基础——规则的双螺旋结构3）中心法则，共用一套遗传密码细胞工程1、细胞工程的概念利用细胞融合技术把含有不同遗传物质的细胞合成杂种细胞。并使之分裂生长成为杂种生物。它包括体细胞融合、核移植、细胞器摄取和染色体片段的重组等。细胞工程操作水平：细胞整体水平或细胞器水平目的：定向改变遗传物质或获得细胞产品。2、细胞工程的理论基础——细胞全能性依据——生物体的每一个干细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质。异种植物细胞杂种细胞转基因植物异种动物细胞动物细胞群重组细胞体细胞细胞核早期胚胎受精卵去核卵细胞克隆动物试管婴儿动物细胞融合植物体细胞杂交植物组织培养动物细胞培养核移植胚胎移植体外受精3、主要技术植物组织培养植物体细胞杂交动物细胞培养动物细胞融合单克隆抗体技术胚胎移植核移植植物细胞工程技术动物细胞工程技术酶工程酶工程是利用酶的特异催化功能，在常温长压下将一种物质转化为另一种物质，以获得高纯度的适用之物。该技术包括各种酶的开发和生产。酶的分离和纯化技术等。酶工程用于食品工业很有效。啤酒、酱油、葡萄糖等都可用酶工程生产。二、生物工程在现代工、农、医领域中的应用1.化工及冶金工业2.轻工和食品工业4.农业和畜牧业3.医药工业5.环保和能源工业稀少珍贵的蛋白质药物1982年，美国食品与药物管理局批准了首例基因工程产品—人胰岛素投放市场——它标志了基因工程产品正式进入到商业化阶段。人生长激素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、a-干扰素、纤维素酶、抗血友病因子、红细胞生成素、尿激酶原、白细胞介素-2、集落刺激因子、乙肝疫苗等等畜牧业中的应用动物疫苗、生长激素等例：从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA（组织溶解酶原激活剂）。种植业中的应用用携带外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生质体，使外源DNA与植物染色体DNA整合，通过原生质体的培养分化成愈伤组织，最后发育成具有新性状的完整植株—转基因植物基因工程包括DNA重组技术和其他使基因结构得以定向改造的技术。本节主要介绍DNA重组技术，大体上包括下列5个步骤。基因工程是1973年由美国斯坦福大学科恩和旧金山大学医学院的博耶创立的概念第二节基因工程DNA重组的技术路线ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmoleculeIntroductionintohostcellsbytransformationHostchromatemeSlectionforcellscoteiningarecombinantDNAmoleculeCloning+1、目的基因的制备2、载体的构建3、目的基因与载体的重组4、重组体导入宿主细胞进行扩增5、克隆基因的鉴定一、目的基因的获得二、基因载体三、重组DNA的筛选及表达一、目的基因的获得1.限制酶——特异性切割DNA的手术刀2.取得目的基因的方法——分离法及合成法1.限制性内切酶DNA重组即是将两种DNA分子经过切割，选择适合的片段连接起来的过程实现这一步，是在限制性内切酶发现以后才实现的限制性内切酶：一类核酸内切酶，可以将外源DNA在特定位点切割降解。以后从细菌中分别分离出了I型和Ⅱ型两类限制性内切酶。限制性内切酶的命名用细菌同名的第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）构成酶的基本名称。若酶是从其中一种特殊菌株来，还在基本名称后加上菌株名称符号。名称后的罗马数字，表示在该特殊菌株中发现此酶的先后次序。如HaeII是从（Haemophilusaegypticus）中提取的，并且是从中发现的第二个酶。限制性内切酶切割DNA的方式a.从识别序列的中间切开b.在识别序列对称轴的左右两方进行切割c.在识别序列对称轴的右边（5’-3’链）和对称轴左边（3’-5’链）切开a.从识别序列的中间切开从识别序列的中间切开产生平齐末端（bluntends），如HaeⅢGGGGCCCC3'5'5'3'5'3'b.在识别序列对称轴的左右两方进行切割即分别在5’-3’链和3’-5’链对称轴的左右方切开，形成带有凸出的5’磷酸基团的粘性末端（Cohesiveends），如EcoRⅠCTTAAAATTCGG5'3'3'5'c.在识别序列对称轴的右边（5’-3’链）和对称轴左边（3’-5’链）切开形成带有凸出的3’羟基的粘性末端，如pstICTGCAGACGTC3'5'G5'3'2.取得目的基因的方法——分离法及合成法（1）DNA片段的直接提取（2）用噬菌体或质粒直接从宿主细胞中将目的基因携出（3）使用相应的mRNA分离基因二、基因载体1.质粒——染色体以外的遗传单元2.噬菌体——感染细菌的病毒质粒是一种环状双链的DNA分子。自身在细菌细胞中能不断复制繁殖。研究比较深入的质粒有大肠杆菌的性因子（F因子）、大肠杆菌素因子和抗药因子等抗药因子（质粒）在其DNA上编码有某些酶的基因，表达产生的酶对链霉素、氯霉素、磺胺、青霉素、四环素、卡那霉素等药物能产生生物化学修饰，使之钝化而失效1.质粒——染色体以外的遗传单元质粒的作用质粒DNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌。这个过程称转化。转入的质粒DNA仍能进行复制，这种性能为DNA重组技术提供了重要的条件，即将一种外源基因与质粒重组后，再转入细菌中去复制繁殖，使外源基因得以增殖。质粒自身的某些抗药基因成为从转化的细菌中筛选它们的一种标记。除质粒外，噬菌体、病毒也能通过“感染”将外源基因带入细菌并进行复制。目前所使用的质粒目前实验中所使用的质粒、噬菌体和病毒载体种类很多。但都是经过了人工改造，更适宜运用于DNA重组技术。它们既保留了转化和感染活细胞的能力，又具有多处携带外源DNA的酶切位点，并含有特殊的筛选标记这些载体中有些只能复制扩增带入的外源基因；有些可以使外源基因复制、转录和翻译出基因的蛋白质产物，这种载体称为表达载体pBR322质粒的结构以噬菌体或病毒为载体，将所需基因或含有此基因的DNA片段转移给受体细胞的过程，称为转导。我们常常采用噬菌体作为基因工程的载体，其一它的遗传结构与功能知道得比较清楚；其二是易于使细胞感染，易于使外源DNA导入宿主细胞。2.噬菌体——感染细菌的病毒以噬菌体为载体进行DNA克隆DNA用限制性内切酶除去中间一段与外源DNA连接重组载体的体外包装带有外源DNA的噬菌体太小不能被包装头部前体多联体DNAA蛋白COSCOSCOS成熟的颗粒在宿主细胞内进行DNA的装配过程三、重组DNA的筛选及表达1.转化——带有目的基因的载体进入受体细胞2.筛选——从大量受体细胞选出带有重组体的细胞3.表达——外源DNA在受体细胞的转录和翻译1.转化——带有目的基因的载体进入受体细胞由质粒作载体形成的克隆，转入细菌时细菌预先要在低温条件下用氯化钙处理，形成“感受态”细胞。即增加细胞膜的通透性才能实现转化。由噬菌体作载体的克隆，转入细胞的过程称为“侵染”。因噬菌体具有自动侵入的功能。细菌不用预先处理。噬菌体感染大肠杆菌的途径+要插入的外来DNA质粒载体连接重组DNA分子经转化或病毒感染导入宿主细胞对含有重组DNA分子的选择无性繁殖（克隆）重组DNA分子合成和克隆过程宿主染色体2.筛选——从大量受体细胞选出带有重组体的细胞（1）插入失活法（2）放射性探针检测法（3）R-环检测法（4）免疫测定法（1）插入失活法在现在的基因工程操作中，所使用的载体通常是经过加工改造的衍生物，它们要么带有一个或几个可供选择的遗传标记，要么具有被选择的遗传功能，这就使带有目的基因与不带目的基因的细菌有明显区别，便于筛选。pBR322质粒结构如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活如果外源DNA插入，四环素抗性基因失活（2）放射性探针检测法利用mRNA可与相应的DNA段落杂交，来检测有外源DNA插入的重组体，是一种快速而灵敏的方法。（3）R-环检测法在有利于形成R-环的条件下，使待检测的纯化的质粒DNA，在含有mRNA的缓冲液中局部变性。如若质粒DNA存在着与mRNA探针互补的序列，mRNA就会取代DNA中一条链，与另一条链形成双链杂交分子，从而形成R-环结构，在电子显微镜下观察，可直接观察到R-环。这样可检出重组体质粒DNA。（4）免疫测定法免疫法测定只能是所转移外源DNA必须表达后才能进行，而且必须具备有效的特异性抗体。Southern和Western印迹法DNAfrangmentElectrophoresisTransferofDNAbyblotting32P-labledDNAprobeAutoradiographyAgarrosegelAutoradiogramNitrocellulosesheetAutoradiogramPolymersheetSDS-PolyacrylamidegelTransferproteinAddradiolabledspesficantibody,WashtoremoveunboudantibodyProteinbanddetectedbyspecificantibodyAutoradiography3.表达——外源DNA在受体细胞中的转录和翻译带有目的基因的载体转移到受体细胞成功并筛选出来后，最终目的是要目的基因在受体细胞中得以表达，产生具有功能性的蛋白质或肽。第三节蛋白质工程一、蛋白质工程的概念二、蛋白质工程的一般技术三、蛋白质工程的应用一、蛋白质工程的概念蛋白质工程(proteinengineering)：通过改造与蛋白质相应的基因中的碱基顺序，或设计合成新的基因，将它克隆至受体细胞中，通过基因表达而获得具有新的特性的蛋白质技术1、基因定点突变——定做新蛋白质2、蛋白质设计——对天然蛋白质的修饰蛋白质工程举例：定点突变技术：已知丝氨酸是由TCT编码，只要把C改为G，就变成半胱氨酸的密码TGT。于是用人工合成一段寡聚核苷酸引物，引物里含有TGT外，其余均与基因部分互补。打开含有被突变蛋白质基因的质粒的双条链成单链模板，用引物与之互补链退火（假如退火在适宜温度下进行，约15个碱基中，有一个碱基错配是可以容忍的）。然后由DNA聚合酶延伸引物，由DNA连接酶将双链再连接成环，转入宿主细胞复制，即产生两种子代质粒。一半的顺序中含有TCT顺序，另一半含有TGT顺序。表达具有TGT顺序的质粒，即可以产生在同一部位上半胱氨酸代替丝氨酸的蛋白质。二、蛋白质工程的一般技术1、蛋白质工程的理论设计——蛋白质工程的前提2、点突变法——基因修饰的方法（1）基因的全化学合成（2）基因直接修饰法（3）盒式突变技术三、蛋白质工程的应用1、蛋白质工程酶—酶特性的改造（1）改变酶的催化活性（2）改变酶的底物专一性（3）提高酶的稳定性（4）酶的反应特性改变（5）产生新酶2、合理药物设计—蛋白质工程用于新药研制譬如：胰岛素原的人工合成胰岛素原的人工合成胰脏(A)n胰岛素原mRNAcDNA重组质粒转化细菌mRNA反转录酶胰岛素原基因与质粒连接感染E.coli胰岛素原TheEnd谢谢观赏