1基因工程概论

第一章绪论第一节基因工程诞生的理论基础一.确定了遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质。明确了遗传的物质基础问题1.肺炎双球菌转化实验1944年Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。2.噬菌体转染实验1952年AlfredHershy和MarshaChase进一步证明遗传物质是DNA二.揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递的问题。1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。三.提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题1958年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则”1964年MarshallNirenberg和GobindKhorana等终于破译了64个遗传密码F.Jacob和J.Monod在1961年提出了操纵子学说第二节基因工程诞生的技术基础一.DNA分子的体外切割与连接1.限制性内切酶（restrictionenzymes）WernerArber理论预见限制酶1968年H.O.Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片断3人于1978年获得Nobel生理或医学奖2.DNA连接酶（ligase）1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶二.DNA分子的核苷酸序列分析1975年F.Sanger、A.Maxam和W.Gilbert发明了DNA快速测序技术,1980年Nobel化学奖三.载体的构建1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增四.转化技术1970年M.Mandel和A.Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S.Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA五.琼脂糖凝胶电泳和southern转移杂交技术1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开;DNA印迹技术由Southern于1975创建,称为Southern印迹技术第三节基因工程发展史上的某些重要事件1869年，F.Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离到DNA1944年，O.T.Avery等人在肺炎链球菌转化实验中发现遗传信息的携带者是DNA，而不是蛋白质1952年，A.D.Hershey和M.Chase再次证明T2噬菌体的遗传物质是DNA1953年，J.D.Watson和F.H.C.Crick提出双螺旋结构模型1958年,Meselson米西尔森和Stanl斯坦尔提出了DNA半保留复制模型1961年，马太(Matthaei)和尼伦伯格(Nirenberg)破译了第一批密码子，F.Jacob和J.Monod提出了操纵子模型1962年，Arber等人发现限制性内切酶1968年,Smith和wilcox在流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性内切酶HindIII1967-1968年，发现了DNA连接酶，建立了DNA序列分析方法1972年，得到了第一个重组的DNA分子1973年，完成了第一个细菌基因的克隆1974年，首次实现了异源真核生物的基因在大肠杆菌中的转化1978年，用大肠杆菌表达人工合成的人脑激素和人胰岛素1981年，成功获得了第一个转基因小鼠，培育出转基因果蝇1982年，第一个由基因工程菌生产的药物:胰岛素1983年，第一个转基因植物培育成功1986年，基因工程生物在控制的情况下，实验性地释放到环境中1988年，开始人类基因计划1994年，基因工程西红柿在美国上市2000年，人和拟南芥测序完成2006年，水稻基因组测序完成第四节基因工程的定义及其主要的研究内容一.基因工程的诞生1.Berg的开创性实验1972年斯坦福大学的PaulBerg小组完成了首次体外重组实验：将SV40的DNA片断与噬菌体的DNA片断连接起来(用DNA末端转移酶，而非限制性内切酶)。2.Boyer-Cohen实验1973年斯坦福大学的S.Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。Boyer-Cohen实验StanleyCohenHerbBoyer1986Nobel生理或医学奖二.基因工程的定义和特征1.定义在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构建遗传物质的新组合，并使之渗入到原先没有这类分子的寄生细胞内，而能持续稳定地繁殖在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物2.特征(1)按照人们的主观愿望进行设计(2)跨越物种屏障外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖(3)无性扩增外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达3.基因工程（geneengineering）相关的概念：基因操作（genemanipulation），重组DNA技术（recombinantDNAtechnique），基因克隆（genecloning），分子克隆（molecularcloning）4.Clone(名词)：是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子细胞或个体所组成的特殊的生命群体Clone(动词)：是产生一个遗传上同一的DNA分子细胞或个体所组成的特殊的生命群体的过程5.研究内容(1)目的基因的获取从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断(2)重组体的制备将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上(3)重组体的转化将重组体（载体）转入适当的受体细胞中(4)克隆鉴定挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）(5)目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物第五节基因工程的安全性一.1996年美国国立卫生研究院公布了“重组DNA研究准则”在实验室安全防护方面，明确规定了物理防护和生物防护两个方面的统一标准。物理防护为P1——P4四个等级，生物防护则分为EK1——EK3三个不同的等级1.实验室的物理安全P1——P4是关于基因工程实验室物理安全防护上的装备规定。P1级实验室为一般的装备良好的普通微生物实验室；P2级实验室，在P1级实验室的基础上，还需装备负压的安全操作柜；P3级实验室，即全负压的实验室，同时还要装备安全操作柜；P4级实验室是具有最高安全防护措施的实验室，要求建设专用的实验大楼，周围与其它建筑物之间应留有一定距离的隔离带，细菌操作带手套进行，以及使用其他必要的隔离装置，使研究者不会直接同细菌接触。P=Protect2.实验室的生物安全生物防护方面，EK1——EK3级是专门针对大肠杆菌而规定的安全防护标准。它是依据大肠杆菌在自然环境中的存活率为前提制定的。EK1级大肠杆菌菌株，在自然环境中一般都要死亡。而符合2-3级标准的大肠杆菌菌株，在自然环境中则是无法存活的。第一个安全的大肠杆菌是K12菌株，由于不适用于操作，目前广泛应用的是K12的派生菌株。3.载体的安全应该是失去了自我迁移的能力，不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌株中。二.实验操作的安全性注意有毒生物对人的危害！！！！注意有毒试剂对人的危害！！！！三.基因工程产物或产品的安全性1.转基因作物对生态环境可能的影响，如产生超级杂草具有除草剂耐性因子的转基因作物的遗传因子可能通过授粉和种子迁移传播给野生植物。获得这些耐性后的野生植物有可能会变成对一般除草剂有耐性的“超级”杂草。为了清除这些杂草，将不得不使用更强大的，浓度更大的除草剂，这必然会引起土壤板结、土质变坏、药物残留等，从而对生态环境造成破坏。2.标记基因的传递可能引起的抗生素耐性基因工程技术中应用的标记基因通常是一类抗生素基因，人们担心食用含有此类标记基因的食品后，是否对肠道微生物产生影响或者抗生素类药物产生耐药性。3.转基因食品引起的食物过敏的可能性转基因食品引起食物过敏的可能性是人们关注的焦点之一。特别是如果转基因食品转入的蛋白质是新蛋白时，这些异种蛋白有可能引起食物过敏。4.毒性方面，如蛋白酶抑制剂，溶血剂，神经毒素许多食品原料生物本身会产生大量的毒性物质，如蛋白酶抑制剂、溶血剂和神经毒素等，那么转基因作物中是否有毒素以及毒素的含量就成为争议的重要内容之一5.伦理方面许多民族都有其独特的饮食习惯和制约，某些宗教团体禁止食用的动物基因转入他们通常食用的动物中（如将猪的基因转入绵羊中），这可能触犯某些民族的饮食戒律；另外将动物基因转入植物中可能使素食者感到困惑。6.其他除以上争论外，对转基因食品安全性的争议还表现在微生物作为宿主细胞的安全性问题，转基因动物激素、食品、饲料添加剂等对动物本身的生长、发育和繁殖的安全性问题等方面。基于上述诸多方面的异议，转基因食品的安全性问题的研究成为转基因技术研究的一个热点。所以关于GMO（geneticmodifiedoriganism）的争论主要集中于安全性，宗教，贸易四.转基因生物安全性评价对转基因生物安全评价主要集中在环境安全性和食用安全性两个方面。1.环境安全性评价环境安全性评价的核心问题是转基因生物是否会将所转基因再转移到其它生物中，会不会破坏生态环境，打破原有生物种群的动态平衡，包括：①转基因作物本身成为杂草的可能性；②转基因作物便亲缘野生种成为杂草或超级杂草的可能性；③转基因作物可能产生新的病毒或疾病；④转基因作物对非目标生物的危害；⑤转基因作物作为外来种对新环境的入侵，使生物多样性受到威胁；⑥转基因作物对生态系统及生态过程的影响；⑦其他一些不可预计的风险。2.食用安全性评价食用安全性，主要包括营养成分、抗营养因、毒性和致敏性等。目前普遍公认的食用安全性评价的原则是经合组织（OECD）1993年提出的“实质等同性”（Substantialequivalence）原则。（1）实质等同性原则实质等同性原则最早由国际经济互助开发组织于1993年提出并已被大多数国家采用。该原则认为如果导入基因后产生的蛋白质经确认是安全的，或者是转基因作物和原作物在主要营养成分（脂肪、蛋白质、碳水化合物等）、形态和是否产生抗营养因子、毒性物质、过敏性蛋白等方面没有发生特殊的变化的话，则可以认为转基因作物在安全性上和原作物是同等的，对人类的影响是相似的，则无需对它的安全性再作进一步的分析。根据“实质等同性”原则，转基因食品安全性分成三个等级：I级，转基因食品成分、营养价值、体内代谢途径、杂质水平和传统食品相同，或变异在已知的范围内，这类食品无需做进一步的分析评价；Ⅱ级，与传统食品极其相似，但产生或缺少某个新成分或特性，对不同成分或特性应作进一步的分析评价；Ⅲ级，与传统食品既不相同也不相似，需要作广泛的营养学和毒理学评价。（2）转基因食品的食用安全性转基因食品与相应的传统食品相比，至少存在以下两个不同点：一是转基因食品中含有利用转基因技术导入的外源基因，而传统的食品中不含有；二是由于外源基因的表达使转基因食品中含有了特定的外源基因表达产物(相应的蛋白质）。A.外源基因的毒性及其水平转移问题转基因食品中外源基因含量很小，其化学组成与普通DNA并无差异。通过食用转基因食品而摄入体内的外源基因的数量与消化道中来源于其他食品中的DNA数量相比微不足道。因此，转基因食品中的外源基因本身不会对人体产生直接毒害作用。转基因食品中的外源基因特别是抗生素抗性基因（Antibioticresistancegene）被摄入人体后，水平转移（Horizontalgenetransfer）至肠道生物或上皮细胞，从而对人体产生不利影响的可能性非常小，也没有在人类消化系统中细菌转化的报道。转基因食品中的卡那霉素、新霉素和潮霉素对人类不存在抗生素医疗安全性的问题。B.外源基因编码蛋白