石蜡包埋组织RNA快速提取试剂盒-(离心柱型)

北京百泰克生物技术有限公司BioTekeCorporation地址：北京海淀区留学人员创业园电话：[phone]传真：[phone]网址：@bioteke.com一般实验室使用，仅用于体外石蜡包埋组织RNA快速提取试剂盒（离心柱型）用于快速提取各种动植物细胞/组织高纯度总RNA目录号：RP5321（50次）RP5322（100次）使用手册2010年4月，第1版北京百泰克生物技术有限公司BiotekeCorporation一、试剂盒组成、储存、稳定性试剂盒组成保存50次（DP5321）100次（DP5322）裂解液MRL4℃避光55ml55ml×2溶液PTL室温15ml30ml蛋白酶K-20℃1ml1ml×2去蛋白液RE室温30ml60ml15ml25ml漂洗液RW4℃（一个月）-20℃（长期）第一次使用前按说明加指定量乙醇RNase-freeH2O室温10ml20ml9mlRNase-freeH2O18mlRNase-freeH2O70%乙醇室温第一次使用前按说明加指定量乙醇RNase-free吸附柱RA室温50个100个收集管（2ml）室温100个200个本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。注意事项1．第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!2．所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。3．不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。裂解液MRL可以常温运输，收到后4℃避光保存。4．避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。六、疑难解答（Troubleshooting）出现的问题可能的原因建议解决方法样品裂解或者匀浆不彻底样品太厚，蛋白酶K活性降低使用的样品或者裂解物在－20℃或者－70℃存放太久存放时间过长可能降低RNA产量，应尽快的处理样品或者裂解物。组织本身含RNA少不同类型的组织和细胞含有不同量的RNA,对于含量少的组织应该适当提高起始处理量。超过了吸附柱的最大吸附能力同一个样品使用多个吸附柱，然后合并得到RNA。RNA产量低漂洗液RW内忘记加乙醇第一次实验时，漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇。OD260/OD280吸光度比值1.6分光光度计检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下，OD280值会较高，造成比值低。检测时用TE稀释样品污染了蛋白或者苯酚做步骤9吸取取上清水相的时候小心不要吸取到中间相和下层有机相基因组DNA污染起始样品量超出了裂解液RL的处理范围选择合适的起始处理量。样品中含有有机溶剂（如乙醇，DMSO等），强缓冲液或碱性溶液。避免这些可以改变裂解液MRL性质或者PH值的物质。【百泰克生物】定货热线：010-62951781Email:[e-mail]【百泰克生物】定货热线：010-62951781Email:[e-mail]-1--6-【百泰克生物】定货热线：010-62951781Email:[e-mail]-7-接前表出现的问题可能的原因建议解决方法吸取上清时吸入了中间相做步骤9吸取取上清水相的时候小心不要吸取到中间相。RNA提取所用各种物品和试剂没有灭活RNA酶按照注意事项准备RNA提取的各种用品。组织取出后没有马上处理或冷冻，提取前已经降解组织应该尽量立刻处理，不能及时处理的应该尽快保存于液氮或者－70℃。提取的RNA样品没有保存在－20℃或－70℃低温尽可能的将RNA保存在－70℃的低温。RNA降解，完整性不佳样品提取过程中降解提取动作应该尽可能的快，离心应该低温进行，取用RNA时尽量冰上进行。下游的RT-PCR实验不成功忘记做步骤10，或者将吸附柱取出时下端碰到了收集管里面的漂洗液，造成洗脱下来的RNA含有乙醇，乙醇抑制了逆转录反应确保做了步骤14，然后小心取出吸附柱，可以在空气中晾几分钟，让残留乙醇挥发。目录一、试剂盒组成、储存、稳定性………………………………1二、原理简介……………………………………………………2三、试剂盒特点…………………………………………………2四、注意事项……………………………………………………2五、操作步骤……………………………………………………4六、疑难解答……………………………………………………63．预防RNase污染，在实际的操作中应遵循以下指南（参见《分子克隆》）*全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。*使用灭菌的、一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。*使用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时，塑料器皿可以在0.5MNaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。4．考虑到环保问题，本试剂盒不含有实验室常用试剂氯仿，用户使用前需要自备氯仿。5．常规的琼脂糖凝胶电泳和变性胶电泳均可以用来分析大RNA的质量。好的RNA产物在电泳后应该可以看到明显的二条优势核糖体RNA带，分别为~5Kb（28S），~2Kb（18S），条带亮度比值约为2：1。6．检测OD260/OD280吸光度比值时，RNA样品应该溶于TE后检测，如果用水稀释后检测，由于一般水离子强度和PH值低，会使OD280升高，从而使比值降低。7．加入裂解液MRL匀浆后，加氯仿前，样品可在–60℃-70℃保存一个月以上。五、操作步骤*第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量乙醇!1．将石蜡包埋的组织切成5–10µm的薄片后置于1.5ml离心管中。2．加入1ml二甲苯，涡旋振荡10秒。3．室温12,000rpm离心2min。去掉上清液，小心不要去掉沉淀。4．加入1ml无水乙醇，涡旋混匀，室温12,000rpm离心2min。5．去掉上清液，小心不要去掉沉淀。室温晾干10min或直至残留的乙醇已挥发完全。6．加入240μl溶液PTL和10μl蛋白酶K溶液，涡旋混匀。55℃孵育15min，再80℃15min。7．加入750μl裂解液MRL，涡旋混匀，室温放置2min。8．加入0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。9．于4℃12,000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。把水相（约600μl）转移到新管中，进行下一步操作。10．加入等体积70％乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!），颠倒混匀（此时可能会出现沉淀）。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中（吸附柱套在收集管内，溶液太多可分次过柱）。11．10,000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。12．加500μl去蛋白液RE，12,000rpm离心45秒，弃掉废液。13．加入700μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm离心60秒，弃掉废液。14．加入500μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。【百泰克生物】定货热线：010-62951781Email:[e-mail]【百泰克生物】定货热线：010-62951781Email:[e-mail]-3-－4－【百泰克生物】定货热线：010-62951781Email:[e-mail]【百泰克生物】定货热线：010-62951781Email:[e-mail]－5－－2－15．将吸附柱RA放回空收集管中，掀开离心柱盖，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。16．取出吸附柱RA，放入一个RNasefree离心管中，加入30μlRNasefreewater（事先在65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。收集得到纯净RNA保存于-20°C或者更低。二、原理简介改进的异硫氰酸胍/酚一步法裂解细胞和灭活RNA酶，然后总RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的RNasefreewater将纯净RNA（microRNA）从硅基质膜上洗脱。三、试剂盒特点1．离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。2．结合了异硫氰酸胍/酚一步法试剂稳定性好，纯度高和离心柱方便快捷的优点，不需要异丙醇沉淀和乙醇洗涤过程，RNA可以直接从离心柱上洗脱避免了过度干燥不易溶解问题。3．独有的MRL裂解液配方，可以有效的消除基因组污染。4．多次漂洗去蛋白过程，提取RNA纯度更高。四、注意事项（实验前必须首先阅读这部分！）1．为防止RNA降解，所有离心步骤如未加说明，均在4℃低温进行。使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf5415C或者类似离心机。2．裂解液MRL中含有刺激性有害化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。