流式细胞仪使用一般方法及技巧

流式细胞仪标本处理一般原则及方法流式细胞仪使用一般方法及技巧临床流式细胞仪应用简介殷跃锋流式细胞仪原理介绍双光源系统流式细胞仪在管道大约50倍直径距离处，鞘液中心速度与边缘速度达到稳定，形成稳定的层流。样本与鞘液未入管道时，边缘与中心速度一致。进入管道后，受管壁粘性阻力边缘速度下降，中心速度不变。流体形成层流后，会产生流体聚焦效应，所有颗粒均被推致流速最快的液流中。颗粒以衡定的速度作匀速运动。无论每秒检测数量为多少，颗粒经过检测区的速度是衡定的流式细胞仪标本准备染色的一般原则及方法标本来源：外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。根据各种具体实验，选用不同的抗凝剂。可用的抗凝剂如下：EDTA：2mg/ml枸椽酸钠：0.38%肝素：15IU/ml标本处理时间：新鲜样本分析时，样本采集后应立即分析样本固定方法：1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分钟。注：不同的实验，所用的固定方法不完全相同。样本处理标准试剂：一、10%BovineSerumAlbuminBSA1.溶解10gBSA至100ml蒸馏水中2.4ºC，20000g离心30分钟3.分装后-20ºC保存二、0.1%BSA-PBS缓冲液1.准备500ml，PH7.3PBS2.加入5ml10%BSA3.使用0.45um滤网过滤三、氯化铵溶血剂1.在一升蒸馏水中溶解8.29gNH4CL,1gKHCO3和37mgNa2EDTA2.调节PH值至7.23.在使用前配置该溶血剂，并用0.45um滤膜过滤方法一：溶血法1.取100ul抗凝全血；2.快速加入2mlNH4CL溶血剂,混匀；3.室温孵育10分钟；4.4ºC，400g离心10分钟。去上清，加入2mlBSA-PBS；5.4ºC，400g离心10分钟。去上清，加入2mlBSA-PBS；6.4ºC，400g离心10分钟。去上清，调整细胞浓度至5x106/ml。富集白细胞注：化学试剂直接作用于红细胞的溶血剂有：以草酸为主的溶血剂（CoulterQ-Prep），基于NH4CL的BD公司的FACSLyse溶血剂。优点：溶血时间快？？？，在流式细胞仪上可清楚地将淋巴、单核、粒及红细胞碎片相区分。缺点：需严格掌握溶血时间，对白细胞表面抗原有影响，随时间细胞形态变化大。方法二：密度离心法提取单个核细胞Histopaque1077为Ficoll与Sodiumdiatrizoate(泛影酸钠)混合物，其密度为1.119～1.077。通过离心可将全血中的粒细胞与单个核细胞分离。粒细胞沉积于1.119～1.077的血浆层，而单个核细胞则在1.077以下的血浆层中。1.准备2ml抗凝血（根据实验要求确定用血量），等量PBS稀释；2.准备1mlHistopaque1077(Sigma)；3.室温下700g离心30分钟；4.仔细将含有单个核细胞血浆层吸出；5.加4mlBSA-PBS，400g离心10分钟；6.加2mlBSA-PBS清洗2次。操作淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织由于结构松散，容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤便可。从组织获取淋巴细胞1.将样本置于陪替氏培养皿，加入15mlBSA-PBS；2.将样本切成3-4mm3大小，用镊子将其分离；3.将样本经滤网过滤，用密度法分离、提纯淋巴细胞。方法：其他标本：通常在其他组织中分离淋巴细胞需用酶进行消化。对于不同标本，处理方法也各不相同。制备大鼠肾脏浸润细胞解剖刀、CO2孵育箱、滤网以及含1mg/ml胶原酶的细胞培养液（无血清）材料：方法：1.将样本置于皮氏培养皿，用解培刀切成小块；2.加入10ml胶原酶溶液，37ºCCO2培养箱孵育30分钟；3.滤网过滤；4.密度梯度法离心提纯淋巴细胞。其他类型细胞在组织中提取细胞通常使用酶消化法。同样对于不同组织处理方法也各异，以下是讲述通用的胶原酶消化法制备组织细胞。改良后的此法尚可用于制备人、鼠上皮细胞。材料1.解剖刀2.0.15%胰蛋白酶3.Hanks’s缓冲盐或PBS，pH7.34.不含Ca、Mg离子的HBSS5.II型胶原酶6.1%BSA或5%FBS7.5ml的吸样管8.35um尼龙滤网9.DNase1.将样本置于皮氏培养皿，加15mlBSA-PBS，将样本切成1mm3大小，用镊子将其分离；2.HBSS或PBS洗清3.加入10ml无Ca、Mg离子0.2%II型胶原酶溶液0.02%DNase1的HBSS；4.37ºC摇床上孵育15~60分钟，视样本类型而定；操作5.用5ml的吸样管反复吹打，制成单个细胞悬液；6.使用35um滤网过滤，300g离心5分钟；7.用PBS或细胞培养液重悬样本；对于某些样本过滤后仍有小块组织，重复第5步获取细胞，重复第7步；8.用含0.15%胰酶、0.02%DNase1不含Ca、Mg的HBSS重悬，37ºC孵育一段时间加入1%BSA或5%FBS，灭活酶活性。细胞培养许多原代细胞和培养细胞系，都为贴壁型生长。通常先用胰酶处理获得单细胞悬液，需注意消化过度会损害细胞，特别是改变其表面抗原标记。准备单细胞悬液1.仪器和试剂：0.25%rEDTA,pH7.20.25%的胰酶10%血清的培养液2.方法：a.PBS洗涤细胞；b.加入0.25%有胰酶，37ºC处理2~8分钟；c.倒置显微镜下观察，至大部分细胞脱落悬浮后，加入含10%血清的培养液。d.PBS液洗涤细胞，最后配成终浓度为1×106/ml的细胞悬液。样本处理抗体染色一般方法•外周血白细胞分析：100ul全血•血小板分析：1~5ul全血（根据样本血小板数量）•红细胞分析：1ul全血（根据样本中红细胞数稀释后使用）•骨髓：100ul•其他样本，计数后决定使用体积目标细胞数量及检测终浓度：1×106/ml细胞计数方法•传统手工计数：耗时、准确度差•流式细胞仪计数：BD，Coulter仪器：高速4ul/秒，中速2ul/秒，低速0.5ul/秒？partec仪器:最为精密的细胞计数器，直接报告细胞浓度反应体积•样本中加完抗体后，1×106细胞反应体积应不小于100ul。抗体染色•最为普通的抗体染色原则：1×106细胞对1ug抗体（抗体供应商所推荐使用单位），此浓度90%处于过饱合状态精确使用：滴定抗体，抗体对于抗原恰达到饱合浓度SPECIFICANTIBODYNON-SPECIFICANTIBODYCONCENTRATIONAMOUNTBOUND抗体滴定原理流式细胞仪抗体滴定方法33µgs/n=2.51µgs/n=2.10.3µgs/n=2.40.1µgs/n=4.10.03µgs/n=4.80.01µgs/n=4.60.003µgs/n=3.50.001µgs/n=3.2auto65432100102030405060DilutionSignaltoNoiseTITER孵育、溶血、固定•抗体孵育：室温下避光15分钟（某些情况下如：细胞内因子检测需冰育）•溶血：如样本含中有红细胞需溶血（见下页）•样本溶血后需立即上机检测，固定后可放置较长时间白细胞保护型溶血剂Cal-Lyse(其中已含细胞固定剂)：1，100ul外周血，加入100ul溶血剂2，混匀后，室温下孵育10分钟3，加入2ml蒸馏水，混匀后室温下孵育10分钟4，根据实验需要，免洗直接上机检测或400g离心10分钟后PBS重悬优点：试剂为温和型溶血剂，不影响细胞表面抗原及溶血时间无需精确把握各溶血剂性能比较抗体标记荧光素及其他荧光染料•荧光激发及发射原理能量级激发激发态发射激光能量损失标记抗体常用荧光素FITC•激发光：488nm发射光：525nm;使用面最广，价格便宜AlexaGreen具有更佳的能量转移效率及更纯的发射光谱PE•激发光488nm发射光575nm•此荧光的激发效率最佳，故此荧光得到的信号最强•检测某些弱表达的抗原，推荐使用此荧光素•价格较FITC昂贵PE-Cy5TC•激发光488nm,发射光667nm为复合荧光素，荧光激发较率较高，信号强FTIC、PE、PE-Cy5三者为流式细胞最为常的荧光，并经常将三者共同使用进行三色分析PE-Cy7•激发光488nm，发射光767nm•为复合荧光素，2000年后被开发出来，激发效率佳•与前三者联进可进行单激光四色分析（488nm），光谱之间影响较小APC•激发光633nm，发射光660在配有双激光的流式细胞仪上，此荧光染料与FITC、PE、PE-Cy5联用做四色分析。但现在因单激光四色可实现，故使用该染料意义不大。核酸染料染料激发光发射光光源PropidiumIodide495342639488Ethidiumbiromide4933206374887-AminoactinomycinD546647514488AcridineOrange503530(DNA)488640(RNA)ChromomycinA3430580457Hoechst33342395450UVDAPI372456UVPyroninY545565514488ThiazoleOrange509533488YO-PRO-1642661488TO-PRO-3642661630LDS751543712488细胞膜电位、离子、脂类探针•现已发现或开发出来了各种细胞膜电位、各类离子、pH值、脂类探针，运用这些探针在流式细胞仪上可轻易检测各种细胞功能，可实现一些异想不到的效果。•详细信息，见细胞探针公司网站：与流式细胞仪相关的荧光术语•MESF（Moleculesofequivalentsolublefluorochrome）等量可溶性荧光分子：国际标准单位，用来衡量荧光强度•自发荧光：细胞或颗粒在激发照射下会发出各种波长的荧光。白细胞自发荧光强度为650~1150MESF，血小板及其他颗粒自发荧光更低•流式细胞仪精度：分析白细胞要求精度在1000MESF以内，分析其他细胞或颗粒需要更高的精度：300MESF以内第二部分流式细胞仪使用一般方法及技巧上机检测•样本染色及溶血过程处理完后应立即上机检测•打开流式细胞仪：预热及进行质控程序•选择相应的方案或新建方案•加载或重新调节各参数•上样检测技巧一：定位目标细胞群体•寻找细胞群：如标本为外周血，在FS/SS散点图中信号最强的为粒细胞，依次为单核、淋巴、红细胞碎片。要寻找淋巴细胞，可首先调低FS/SS电压定位粒细胞后逐步调高电压依次寻找各细胞群。•使用目标群所特有的表面标志物结合SS信号，可最快、最特异性地定位目标细胞群•如标本中无明显特征细胞群，可使用已建淋巴细胞检测方案根据相对位置定位目标细胞群技巧二：阴性对照•阴性对照作用：调节PMT电压；设立阴、阳性界线•使用抗体相应同型荧光免疫球蛋白作为阴性对照，注对照及抗体需出自同一厂家（检测一过性样本中的某些指标）•使用对照组样本作阴性对照（与其他实验中对照组含意相同，但此时仍需使阴性对照初始化仪器）•对与非抗体染色，如各类核酸染料或探针：PI、ANNEXIN-V。使用空白标本作为阴性对照，或设立阳性对照。技巧三：常见故障及解决•时刻注意鞘液及废液桶液量，熟悉仪器各类报警信号•通过软件操作仪器，很少能引起仪器硬件固障•如样本中有可见颗粒，建议过滤后再检测•如仪器经常不使用，管道会结晶、长菌、堵塞、漏气，此时叫工程师便可解决•如仪器出现硬件故障，通常是仪器自身问题，与操作者无关技巧四：检测指标•检测前要清楚地知道：除阳性百分比指标外，还有荧光强度指标。后者往往比前者更有意义•检测时，灵活应用放大模式：线性或对数（如指标相差不大，使用线性放大，如：SS、FS；一般荧光参数使用对数放大）•灵活运用门的逻辑关系及颜色示踪功能，可使检测结果更为明了•合理选择不同的荧光素标记试剂，以最少的投入获取最多的信息荧光补偿：极其重要的操作FITC与PE调与未调补偿FL1FL2补偿调节原理补偿调节原理双色荧光补偿调节标准方法：第一步•IgGFITC/IgGPE通过调节电压使阴性群体落在FTIC及PE双阴性区注在•进行调补偿时必须将原补偿全部归零双色荧光补偿调节标准方法：第二步•F