Nikon-A1R激光共聚焦扫描

NikonA1R激光共聚焦扫描显微镜操作指南上海科技大学生命科学与技术学院2016年7月A1R操作说明书1目录1.激光共聚焦显微镜组件介绍.............................................................................21.1显微镜主机介绍................................................................................................21.2显微镜调试的常用组件....................................................................................31.3遥控器................................................................................................................41.4软件控制............................................................................................................42.激光共聚焦显微镜的使用.................................................................................62.1开机顺序.............................................................................................................62.2显微镜的操作.....................................................................................................73.拍摄共聚焦图像..................................................................................................83.1共聚焦光路调节................................................................................................83.2xy图像拍摄........................................................................................................93.3xyz图像拍摄.....................................................................................................123.4xyt图像拍摄.....................................................................................................133.5大图拍摄..........................................................................................................133.6ROI荧光强度扫描........................................................................................143.7多点序列扫描..................................................................................................154.图像保存和处理..............................................................................................17附录.........................................................................................................................23A1R操作说明书21.激光共聚焦显微镜组件介绍1.1显微镜主机介绍（1）滤光片：包括D---毛玻璃；NCB---色温平衡片；ND---减光片；“GIF”---绿色滤光片和用于PFS的红外滤光片；（2）视场光阑；（3）聚光器升降旋钮；（4）起偏器（DIC用）；（5）聚光器对中旋钮；（6）孔径光阑；（7）聚光器模块（包括明视场，DIC）；（8）滤色块转盘（包括DIC检偏器）；A1R操作说明书3（9）手动荧光光闸；（10）电动焦距调节旋钮；（11）ND减光片；（12）遥控器；（13）透射光电源；（14）汞灯荧光光源；（15）PFS控制器（16）HUB控制器1.2显微镜调试的常用组件前面板控制（1）状态显示屏；（2）PFS开关按钮；（3）光路端口切换按钮；（4）中间变倍旋钮侧面板控制（1）调焦旋钮（2）粗微调切换按钮（3）物镜切换按钮；（4）滤光块，DIC检偏切换按钮（5）透射光光源开关（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此按钮无效）（6）透射光量度调节旋钮（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此旋按钮无效）（7）物镜复位（8）物镜向下移动至最低处（约500um）A1R操作说明书4注意：在使用显微镜之前，要把主机底座右后端的黑色HUB控制器（显微镜示意图15位置）右侧的电源开关打开。1.3遥控器TiPad长寿命汞灯遥控器(1)镜切换按钮(2)滤光块，DIC检偏器切换按钮(3)DIC检偏器快速切换按钮(4)光路端口切换按钮(5)PFSON/OFF(6)聚光器转盘切换按钮(7)透射光源控制按钮(8)荧光光强控制(9)荧光光闸1.4软件控制A1R操作说明书5A1R操作说明书62.激光共聚焦显微镜的使用2.1开机顺序共聚焦部分（1）接通激光台的电源（特别注意488nm和561nm激光器的打开程序）（7）接通共聚焦控制器电源显微镜部分（2）接通汞灯（目视荧光观察用灯）电源，打开约10min稳定，关闭需要超过15min后才可以再次启动（3）接通卤素灯（目视透射光观察用灯）电源（4）接通电动载物台电源（5）Piezo快扫台（不用共振扫描时可略过此步）（6）接通显微镜主体电源计算机部分（8）开启计算机与显示器（9）启动“NIS-Elements”软件（确保上述开机完成后才能打开软件）19StandByA1R操作说明书72.2显微镜的操作（1）明场观察a)打开电源开关，并打开显微镜透射光卤素灯电源开关；b)把滤色块移到空位；c)把起偏器，检偏器移出光路；d)把聚光器切换到A状态；e)检查出光端口。（2）微分干涉(DIC)观察a)按照明视场透射光观察方法调节好显微镜；b)把起偏器，检偏器移入光路；c)按照相对应物镜将聚光器转到相应N1/N2位置（请参见另外所附对照表）；d)检查出光端口；e)旋转起偏器，选择最佳显示效果。（3）荧光观察a)打开荧光电源稍待片刻至光源指示灯不闪（打开约10min稳定，关闭需要超过15min后才可以再次启动）b)确认透射光开关处于关闭状态；c)检查出光端口；d)选择合适的滤色块；e)打开光闸，调节荧光亮度，进行观察；f)不观察时，把光闸关掉，以避免荧光淬灭。A1R操作说明书83.拍摄共聚焦图像3.1共聚焦光路调节（1）打开软件（2）NIS的操作界面（3）按需选择合适的OC（OpticalConfigurations）成像条件（4）建立新的光路OC（OpticalConfigurations）配置如果默认的快捷操作系统无法满足成像的需要，可重新进行CameraSettings设定，建立新的OC。可根据样品情况选择所需染料或者荧光蛋白，并选择是否需要拍摄明场透射光。亦可通过改变探测模式来改变接受光波长范围：[DU4]：标准探测器，[SD]：光谱探测器，[VF]：虚拟滤色片。A1R操作说明书9○1探测器：当前所选探测模式○2通道交替：选择是同时打开所有用于扫描的激光，还是顺序地一次打开一个激光器（用于防串色）○3Setting按钮：打开Opticalpath窗口，用于选择探测器，二向色镜，探测通道以及每个通道所对应的荧光染料，激光等○4状态：各个通道的设置情况(染料名称，激光波长以及探测波长带宽).○5TD：透射探测器状态处于使用中(ON)或是未使用(OFF).最后确认光路设置点击[ok]按钮。确认使用此光路配置，光路设置窗口关闭3.2xy图像拍摄界面调出方式：软件灰色空白处，鼠标右击菜单中选择[AcquisitionControls]-[A1plusCompactGUI]A1R操作说明书10（1）拍摄流程：a)选择共振[Resonant]或检流计式[Galvano]扫描方式。（A1R系统同时含有此2种扫描模式，）如在光谱探测（SpectralDetector）模式和虚拟滤色片(VirtualFilter)模式下，只有检流计式扫描模式可用，因此不能改变扫描模式。b)选择要使用的激光/通道。c)在Pinhole的项目中选择要使用的激光波长。点击按钮，选择与物镜最匹配的针孔尺寸。d)点击[Scan]按钮，边观察图像边调节激光功率和检测器的灵敏度HV。HV：探测器灵敏度Offset：信号的偏移（标准：0）Laser：激光功率（当鼠标移动到相应位置可直接使用滚轮进行精细调节）e)将像素数调整为所需要的分辨率。图像较暗时，请降低扫描速度。A1R操作说明书11f)根据需要进行Average。g)点击[Capture]按钮以获取图像。h)激活要保存的图像，从菜单栏中选择[File]-[SaveAs]以进行保存。（2）图像显示调节点击按钮调出LUTs窗口进行细致的图像显示调节。（3）扫描区域调节点击ScanArea窗口按钮，用鼠标拖动绿色边框，以缩小扫描区域。在鼠标变为十字箭头的状态下移动边框，鼠标右击以决定扫描的位置。可在Zoom中确认缩放倍率。在绿色边框的旋转用点上拖动鼠标，可以进行扫描区域的旋转。在Rotation中可以确认所设定的旋转角度。旋转范围为-90度～90度。缩放区域点右键后，边框变绿，表示区域选定。A1R操作说明书123.3xyz图像拍摄（1）点击软件左边工具栏按钮，启动CaptureZ－Series对话框（如下图）。（2）点击[Definedtop&bottom]按钮。（3）点击[Reset]按钮。（4）点击[Scan]按钮，边观察图像边转动显微镜的调焦手轮（微调模式），点击[Top]按钮，决定Top。（5）点击[Scan]按钮，边观察图像边转动显微镜的调焦手轮（微调模式），点击[Bottom]按钮，决定Bottom。（6）决定Step（7）根据需要，选择[SavetoFile]，在保存的同时获取A1R操作说明书13图像。（8）参照“3.2”Live模式下设置拍摄参数。（9）点击[Runnow]按钮，获取Z序列图像。3.4xyt图像拍摄（1）点击软件左边工具栏按钮，启动CaptureTimelapse对话框。（2）决定时间间隔（Interval）和持续时间（Duration）。（3）选择[SavetoFile]，在保存的同时获取图像。（4）参照“3.2”Live模式下设置拍摄参数。（5）点击[Runnow]按钮，获取时间序列图像。3.5大图拍摄（1）