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江西农业大学农学院植保系王建国2013-11-03分子生物学技术在昆虫分类学中的运用唐觉教授对日本臭蚁的鉴定蚂蚁分类专家—浙江大学唐觉教授来源：新技术在分类学上的运用几乎每一次生物技术方法的进步都会被引入到昆虫的分类中来.1电子显微镜和扫描电镜带来了超微形态学形态上可解决一些近似种的分类2血清学反应方法,同功酶分析3层析法电泳法4蛋白质和氨基酸分析方法,5核酸的研究RAPD,RFLP,分子系统发育分析6数值分类法新的统计分析软件使分类进入数理统计水平传统形态分类技术和新技术的发展使分类工作进入一个高速发展的时代.传统形态分类与现代分类技术的关系。DNA技术在昆虫分类中的运用(见另章节)红火蚁标本实体,粘在三角纸上的干标本一种蚂蚁的电子扫描图象新技术在分类学上的运用(二)红火蚁的头部，示唇基中央齿热带火蚁的头部，无唇基中央齿入侵红火蚁的尾部蜇针高清晰显微镜的运用图1图2图3电泳图辣椒实蝇28号样品30号样品Hex：核酸固定阳性对照；CK+：实验阳性对照，为酵母Y5基因；CK-：实验阴性对照，探针为水溶液。辣椒实蝇28号，30号样品理论杂交模式图ProbeCK+CK-CK+HexHex辣椒实蝇28号，30号样品实际杂交图DNA模型目前，已经定名的昆虫有100多万种，占已知动物的2／3，但是全世界仍约有9o％的昆虫是未知种。随着科学技术的进步以及各个学科的交叉渗透，已有200多年历史的昆虫分类学也获得了极大的发展。常用的昆虫分类技术一、形态学分类法（分支--数值分类法）二、行为学方法（系统生物学）三、遗传学方法四、生化分类方法（酯酶、同工酶等）五、分子生物学方法一、形态学分类法形态学分类法是传统的昆虫分类方法中最基础的方法。该方法主要是根据形态结构与功能相一致的原理。以昆虫的外部形态．内部结构及各部分大小比例等特征为依据，对昆虫进行分类鉴别。目前，昆虫分类系统主要采用的形态学依据有：昆虫的颜色和斑纹；翅的有无、性质以及翅脉脉相：口器的类型及其在个体发育中的变化；触角类型及节数：身体附属物类型及其大小；马氏管的数目；生殖器官及其他结构部位的形态特征。同时，昆虫的变态类型、生活史、宿主范围及地理分布都是重要的参考依据。但是传统的形态学方法有不少的局限，例如一些昆虫的形态特征不稳定、同种异型和异种同型现象、近缘种，形态结构十分相似等问题。扫描电子显微镜热带火蚁Solenopsisgeminata电子显微镜电子显微镜和扫描电子显微镜的问世，使昆虫的形态学分类达到了超微结构水平。五、分子生物学方法目前，应用于昆虫系统演化及分类鉴定方面的分子生物学技术主要有：RAPD技术、RFLP方法、DNA序列分析、分子杂交技术，SSCP方法及DSCP技术等。PCR技术聚合酶链式反应技术PCRPolymerasechainreaction1985年，KerryMullis发明了DNA聚合酶链式反应PCR(Polymerasechainreaction)技术，目前这一技术在分子生物学领域获得了广泛的应用，已经在很大程度上代替了传统的DNA克隆方法。利用PCR技术能够从复杂的DNA分子群体中选择性地复制一段特异的DNA序列，从而使某一DNA片段得到特异性的扩增；同时这一技术在昆虫学领域也得到了广泛的应用。PCR技术常与RAPD技术结合应用，如Kambhampati等(1992),应用RAPD-PCR技术对蚊虫和蚜虫进行了分子系统学的研究。Paskewitz(1993)用PCR技术识别按蚊种类。此外，RFLP、RARDPCR、DNAfp等方法也应用在同翅目蚜科、蝉科和叶蝉科等昆虫的研究方面。直翅目蝗科、鞘翅目叶甲科、鳞翅目凤蝶科等方面也有类似研究。1.RAPD标记技术RandomAmpifledPolymphicDNA随机扩增多态性DNA。RAPD是由williams等1990年发明的一种遗传标记方法，其原理是用随机序列的9～10个核苷酸的引物，对基因组的DNA进行PCR扩增，再进行电泳分离和溴化乙锭染色。多态性的产生由互补核苷酸引物的碱基差别形成。RAPD要求对每个分离群体中的标记所进行的PCR扩增和电泳分离有高度的重复性，所以操作一般采用自动化。目前，RAPD已成为昆虫遗传图谱构建中的一种普遍方法。我国近年来已在果蝇、蚊虫、玉米螟、棉铃虫等昆虫研究中应用RAPD技术在DNA分子水平上进行了研究，取得了一些成绩。RAPD技术一出现，就被用于蚊虫的分子系统学研究。孙珊、徐茂磊等应用RAPD方法对我国黑龙江、北京、陕西、浙江云南和新疆等6个地区的玉米螟种群进行了分析，并通过聚类分析为我国不同地区玉米螟的现代系统学研究提供了新的分类依据。吴厚永、赵彤言利用RAPD技术从DNA分子水平探讨了尖音库蚊复合组4个亚种的分化，结果表明，尖音库蚊是原始的类群，而致倦库蚊和淡色库蚊是最为进化的类群。RAPD标记技术论文1论文22.SCAR技术Sequence-characterizedAmplifiedRegion，SCAR特征序列扩增区域（SCAR）标记法标记通常是由RAPD标记转化而来的。为了提高所找到的某一RAPD标记在应用上的稳定性，可将该RAPD标记片段从凝胶上回收并进行克隆和测序，根据其碱基序列设计一对特异引物（18-24碱基左右）。也可只对该RAPD标记片段的末端进行测序，根据其末端序列，在原来RAPD所用的10碱基引物上增加相邻的14个左右碱基，成为与原RAPD片段末端互补的特异引物。以此特异引物对基因组DNA再进行PCR扩增，便可扩增出与克隆片段同样大小的特异带。这种经过转化的特异DNA分子标记称为SCAR标记。SCAR标记一般表现为扩增片段的有无，为一种显性标记；但有时也表现为长度的多态性，为共显性的标记。若待检DNA间的差异表现为扩增片段的有无，可直接在PCR反应管中加入溴化乙锭，通过在紫外灯下观察有无荧光来判断有无扩增产物，从而检测DNA间的差异，这样可省去电泳的步骤，使检测变得方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体。相对于RAPD标记，SCAR标记由于所用引物较长及引物序列与模板DNA完全互补，因此，可在严谨条件下进行扩增，结果稳定性好、可重复性强。随着研究工作的发展，会有越来越多重要作物农艺性状的SCAR标记被开发出来，它们将在分子标记辅助育种方面发挥巨大作用。3.RFLP技术RestrictionFragrnemLengthPolymorphism限制性片段长度多态RFLP是由于不同个体的等位基因之问碱基代换、重排、插人、缺失等引起的。限制性内切酶能把很大的DNA分子降解成许多较小片段，所产生的DNA片段的数目和长度又反映了限制性内切酶的切割位点在DNA分子上的分布。对于每一个DNA限制性内切酶组合来说，它产生的片段是特异性的，因而它能够作为含有这种DNA的生物所特有的“指纹fingerprint”——DNA指纹(DNAfp)。当一个基因组比较小时，就可以将提纯的DNA用限制内切酶消化成各种不同长度的DNA片段，进行琼脂糖凝胶电泳分离并用溴化乙锭染色后，可以在紫外灯下直接观察多态性，但对于大分子DNA来说各种片段在电泳胶上连成一片，相互重叠，根本无法进行分辨，因此不能直接观察限制性片段长度的多态性。要检测大分子DNA的RFLP，就要借助分子杂交技术，用某一标记的DNA片段作为探针，与电泳后的DNA片段进行杂交，这样，与探针片段有高度同源性的DNA片段就可以被检测出来。目前典型的RFLP研究都选择mtDNA进行。龙漫远(1993)报道了选择mtDNA进行RFLP研究获得DNA限制性内切酶图谱以及片段长度多态性等的分析方法。赵惠燕等在同翅目昆虫的分类方面也应用了同样的分析方法。对于昆虫来说，目前大多数mtDNA的限制性片段长度多态性研究都是在种内或近缘种间进行，而科、属等高级阶元问的分析较少。Chapco(1994)用同样的方法研究了l1种蝗虫之间的演化关系。乔传令等(1996)对库蚊(Culexpipiens)的限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)进行了研究，结果表明不同地理种群都有相同的单基因扩增，但在扩增水平上有较大差异。应用RFLP分析方法，使传统的昆虫分类区系及系统进化研究获得了新的发展和飞跃，解决了一些用传统分类方法无法解决的难题4.AFLP技术AmplifiedFragmentLengthPolymorphism扩增片段长度多态性一项新的分子标记技术，是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。限制性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可做为一种分子标记。AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段。以说AFLP技术是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术5.SSCP技术Single-StrandConformationPolymor-phism，SSCP单链构象多态性检测是一种基于DNA构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开.作者称该方法为单链构象多态性(Single-StrandConformationPolymor-phism，SSCP)分析.基本原理，都是依据DNA分子在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，其迁移率除与DNA的长短有关外，更主要的是取决于DNA链所形成的构象6.DSCP技术Double-StrandConformationalPolymorphism双链构象多态性分析DSCP技术在昆虫分类上的应用不多．在国内未见有相关报道。SequenceandSequencing包括DNA的序列分析和RNA的序列分析。7.核酸序列分析技术在种内或近缘种的系统发育关系确定方面，通常用进化较快的mtDNA核苷酸片段，对于科、属等高级阶元的系统发育研究中，通常用进化较慢的rDNA和rRNA核苷酸片段。现在许多昆虫特别是双翅目的果蝇、膜翅目的蜜蜂、直翅目的飞蝗等的mtDNA的序列已经很清楚了，由于rRNA在昆虫中分布广泛，易于分离，且rRNA属于慢速进化的基因，因此对不同昆虫rRNA的序列分析可以广泛地应用到科、属等高级阶元的系统发育研究。近年来，核酸序列分析方法与PCR及RFLP技术相结合，在昆虫系统发育研究方面取得了一定成就。Chapco(1994)应用按酸序列分析方法对直翅目l1种蝗虫的进化关系进行了研究。曹功杰(1988)对7种昆虫的5SrRNA结构特点进行了比较研究。通过测定DNA，RNA的核苷酸顺序，对昆虫进行分类并构建其系统发育关系，有望在重要的农、林、医学昆虫鉴定上发挥作用。当前核酸测序技术与RAP,PCR及RFLP相结合的综合分析方法，既快速又准确，是今后昆虫分子系统学研究的重要方向。8.DNA条码技术DNAbarcoding9.探针杂交技术Probe探针核酸分子杂交即具有一定同源性的DNA单链分子或DNA单链分子与RNA分子，其互补的区段在去掉变性条件后能够复性形成双链DNA分子或DNA／RNA异质双链分子。核酸的