22基因工程载体-噬菌体载体XXXX09

2012.09第二节噬菌体载体2噬菌体载体（phagevectors）一、噬菌体载体二、单链噬菌体载体三、噬菌粒载体四、柯斯质粒载体一、噬菌体载体噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）（一）噬菌体的一般特性结构：蛋白质外壳内包裹着DNA（双链、单链、线性、环状等）。T4Bacteriophage71.噬菌体的生物学特性溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细菌。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA被称为原噬菌体。噬菌体温和噬菌体，具有溶源生长周期和溶菌生长周期烈性噬菌体,只具有溶菌生长周期分为两种：（1）溶菌周期：噬菌体的生活周期烈性噬菌体（virulentphage)（2）溶原周期：感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化温和噬菌体（temperatephage)2、噬菌体的结构和其核酸类型：结构：无尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型、线状体型核酸类型：最常见的是双链线性DNA、双链环形DNA、单链环形DNA、单链线形DNA、单链RNA。3、λ-DNA的物理图谱λ-DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端）GGGCGGCGACCT,CCCGCCGCTGGA，称为cos区，全长48.5kb。特点是功能相近的基因在基因组中聚集在一起。λ噬菌体组成特点：双链线状DNA分子，全长50kb，含65个基因，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。λ噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长溶菌性生长（lyticpathway）噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。溶源性生长(lysogenicpathway)噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。噬菌体AWBDEFZJattxisNclcroOPQSR结构区重组区调控区裂解区cos位点cos位点ARAREcoRI目的基因插入型置换型AWBCDEFZUVGHMLKIJb2cIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOSCOS头部基因尾部基因功能不明区溶源化重组早期控制阻遏DNA合成溶菌生长非必须区段cI基因：溶源过程控制基因。λ噬菌体的基因组结构5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephagecosendsCircularformLinearform（二）λ噬菌体载体的主要类型（1）插入式载体一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的派生载体。（2）替换型载体（取代型载体）具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。（3）凯伦噬菌体载体（2）λ替换型载体（取代型载体）•外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段(~20kb)•高感染效率(109转化株/ug载体DNA,比质粒高100-倍)e.g.EMBL3,DASH替换式载体野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段，例如Charon4A、λEMBL3/4、Charon40等载体，这些载体是用Lac5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的LacZ）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。（3）凯伦噬菌体载体既有插入型；又有替换型在基因工程实验中的用途十分广泛承受外源DNA的能力：几个kb到23kb（左右臂连接）（三段自身连接）（插入片段）（三）体外包装λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达106~108/μgDNA，而以转染（translation）的方式导入的频率仅为103~105/μgDNA。λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5kb）的75%~105%。由于λ噬菌体包装时，当DNA的长度短于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生型DNA（48.5KB）的75%~105%左右的ＤＮＡ，要求λ载体DNA和外源DNA长度之和在39～53kb之间。插入式载体可携带的外源ＤＮＡ片段较替换式为小。•◆λ噬菌体载体可接受15kb-23kb的外源DNA片段，它既可作为克隆载体，也可作为表达载体，广泛用于各类基因库的构建。筛选标记：蓝白斑(LacZ)、噬菌斑等。重组噬菌体的分子量必须在野生型噬菌体分子量大小的75%至105%之间。用途：b.用于构建基因组或cDNA文库。c.用于抗体库或随机肽库的构建。a.用作一般的克隆载体。（四）λ-DNA的抽提1)大肠杆菌培养至对数生长期2)加入λ-噬菌体或重组λ-噬菌体悬浮液，37℃培养1hr3)用新鲜培养稀释，继续培养4-12hr4)高速离心，沉淀噬菌体5)苯酚抽提，释放λ-DNA6)乙醇或异丙醇沉淀DNA（五）λ-DNA作为载体的优点1)体外包装病毒颗粒，高效感染E.coli2)装载外源能力为25kb，大于质粒3)筛选方便4)重组λ-DNA分子提取容易二、单链噬菌体载体（一）单链噬菌体载体M13、f1、fd噬菌体单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：M13噬菌体单链DNA噬菌体载体M13、f1、fd。优越性：1.单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这种复制形式的DNA简称RFDNA；2.不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌；3.单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的多制约的，不存在包装限制问题；4.容易测定外源DNA片断的插入取向；5.可产生含外源片断的单链DNA分子。3.M13噬菌体噬菌体正链复制复制型DNA经pII蛋白造缺口3′5′经pII蛋白剪切释出单链DNA(正链)进入下一循环5′3′3′5′滚环复制在细菌内的复制模式图M13噬菌体几个重要特点：1.M13噬菌体不溶解宿主细胞，只是降低宿主细胞的生长速度。2.M13噬菌体能以单链和双链两种方式存在，因此可以用感染(经包装的单链DNA)和转化(双链DNA)。3.克隆的外源基因片段不宜大于1000bp。M13噬菌体载体M13是一种含单键（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链ＤＮＡ片段，这种单链ＤＮＡ片段在遗传学研究中主要用来测定ＤＮＡ序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。M13噬菌体的特点•感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型ＤＮＡ（replicationformDNA,RFDNA）。可以象质粒ＤＮＡ那样在体外进行纯化和操作。•成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是RFDNA或ssDNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。•噬菌体颗粒的大小是受其ＤＮＡ的大小制约的，这一点正好与λ噬菌体相反。所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。M13单链DNA噬菌体的生命周期RFDNAPhageM13replicationinthehostcell:+RNApolDNApolIII±RFNickedbygene2protein+ss-Rollingcirclereplication,thencutandligateCoatedwithgene5proteinGene5proteinisreplacedbygene8proteinect.LinearM13phagereleasedfromthecell.（二）M13载体的构建（1）克隆区域的选定①基因间隔区（intergenicregion,IG区）J.Messing证明，IG区存在M13的复制起点，但可以插入外源DNA而不影响M13噬菌体的活力。在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（-肽序列)。利用-肽序列中的三个单一酶切位点（BglII、AvaII和PvuI）。(2)加入酶切位点①在IG区内加入单一内切酶位点第一个M13载体：M13mp1：M13RFBsuI不完全消化各种长度的线性片断（其中应有只在IG上切开的线性全长M13）E.colilac基因的HindII片断(lacI、lacP、lacO、lacZ’）连接M13mp1JM101宿主只有在IG区插入lacZ’才能存活并在Xgal上出现互补的蓝噬菌斑（三）M13系列载体的优点1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段2）Xgal显色反应，可供直接选择3）无包装限制，克隆能力大4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链子代M13噬菌体中包含的是单链+DNA。（四）M13噬菌体用途：1）DNA序列测定；2）制备单链DNA探针；3）用于定点突变的研究。M13载体•具有多克隆位点(MCS)，方便克隆。许多M13载体的多克隆位点与质粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。•可以定向地克隆DNA片段，克隆在M13RFDNA分子上的双链DNA片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离ＤＮＡ分子中的双链，则需要两种独立的克隆。根据M13的生物学特性知道，M13子代噬菌体中总是只含有（＋）链，所以M13载体克隆的外源DNA片段在子代噬菌体中究竟是含有DNA分子中的哪条链，则完全取决于外源ＤＮＡ克隆时的取向。这样一来，为分别分离外源ＤＮＡ分子的两条链带来一定的麻烦，解决这一问题的一个行之有效的方法就是定向克隆技术。M13克隆载体分子结构图三、噬菌粒载体噬菌粒载体由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。噬菌粒载体（phagemidvectors）由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列。MCS噬菌体ori质粒oriAmprlacZ’lacI约3000bp（比M13小）②克隆能力大能插入10kb的外源DNA。③两种复制形式①分子量小1、噬菌粒载体的特点既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。常用的噬菌粒载体pUC118和pUC1191.具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作；2.编码一个ampr基因作为选择记号，因此只有携带pUC118或pUC119噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择；3.拷贝数含量高，每个寄主可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA；4.存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；5.由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5’-端编码区，可按照IPTG组织化学显色反应试验，筛选重组子；6.lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形