23基因工程载体-人工染色体载体XXXX09

第三节其他载体2012.09其他载体•一、人工染色体•二、植物基因工程载体•三、动物基因工程载体一、人工染色体人基因组十分庞大，约含4×109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要1、酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC)酵母人工染色体（yeastartificialchromosome，YAC）◆酵母人工染色体是另一类酵母穿梭载体。具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。◆YAC可以接受100-1000kb的外源DNA片段，这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人类人工染色体(humanartificialchromosome，HAC)的研究。正常酵母人工染色体含有：*四膜虫端粒（tel)*酵母自主复制序列（ARS)*酵母着丝点(CEN)*酵母的选择标记(TRP1、URA1)YAC载体thecapacitytoclonelargeexogenousDNAfragments(upto2Mb)hasmadeYACsavitaltoolinphysicalmappingThefunctionalelementsofayeastchromosome（1）着丝粒区（CEN）AAGTCACGTGTTGTTTCTGNTTTCCGAAAYAC的组成结构酵母染色体着丝粒区的保守序列:78-86bpIIIIII由三个区组成酵母端粒保守序列是(G4T2)n重复序列。（3）复制起点（ORI）约100bp的自主复制序列（ARS）。（2）端粒（TEL）（真核生物中只有酵母菌有ARS）两个端粒序列Tel。位于SUP4基因内部。（4）克隆位点插入失活选择：SUP4酶失活的酵母菌落呈红色；不失活的菌落是白色。142、细菌人工染色体（Bacterialartificialchromosome,BAC）细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome，BAC）◆BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的一些特点构建的。F因子在细菌接合时转移1Mb的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构成的BAC载体，可用于克隆100kb以上的DNA片段。◆带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子，在细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本身分子量小，具有氯霉素抗性选择基因及多克隆位点。Structureofabacterialartificialchromosome(BAC),usedforcloninglargefragmentsofdonorDNA.CMRisaselectablemarkerforchloramphenicolresistance.oriS,repE,parA,andparBareFgenesforreplicationandregulationofcopynumber.cosNisthecossitefromlphage.HindIIIandBamHIarecloningsitesatwhichforeignDNAisinserted.Thetwopromotersarefortranscribingtheinsertedfragment.TheNotIsitesareusedforcuttingouttheinsertedfragment.3、PAC载体二、植物载体Plantcloningvectors•Ti质粒:侵染广泛的双子叶植物•T-DNA或T-区(T-region)：约20kb，包含专化冠瘿碱生化合成和冠瘿瘤生长的基因，随机地整合到植物染色体上。•结构特点：两端具有25个碱基对的顺向重复序列，但重复不是完全的。25个碱基对的序列称为T-DNA的边界序列(T-DNAbordersequence)。去除右边界序列，将使T-DNA失去转移和整合的功能；左边界的缺失，对致瘤性无明显影响。•毒性区域即vir(virulence)区域:引起T-DNA转移的区域。长度约35kb，和T-DNA处于不同位置植物Ti质粒载体（1）T-DNA区（transferred-DNAregions）T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上导入植物细胞的一段DNA。T-DNA两端各有一段25bp的重复序列(LB,RB)。T-DNA携带的致瘤基因是一些与激素合成有关的基因，由于激素合成基因使细胞处于不停的分裂状态，形成冠瘿瘤，不能进行细胞分化。Ti质粒改造后才能应用于植物的基因工程。保留T-DNA两端的末端序列，然后用外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因，使转化的植物细胞不具有成瘤能力。•T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。•Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。（2）Vir区（virolenceregion）Vir区段上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。Vir区段总长度大约35kb，由7个互补群组成，分别命名为VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG和VirH。（3）Con区(regionsencodingconjugations)该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。（4）Ori区(originofreplication)该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。Ti质粒分子受到信号分子的激活作用之后，virD基因编码的一种核酸内切酶，先在T-DNA的RB序列中的第3和第4碱基之间切开一个单链缺口，随后在T-DNA同一条链的LB序列中切出第二个单链缺口。T-DNA便以单链形式释放出来，并在RB序列的引导下定向地转移到寄主植物细胞。在有关的植物细胞酶体系的催化作用下，合成互补链形成双链形式的T-DNA分子。在一系列酶的参与下整合进植物基因组。这种整合是一种非正常重组。T-DNA转移的机制2、Ti质粒载体•DisarmedTivectors（非致瘤载体）•Cointegratevectors（共整合载体）•Binaryvectors（双元载体）1）DisarmedTivectors•去除T-DNA中的肿瘤基因•在T-DNA中插入用于转化植株筛选的遗传标记基因VirOpine合成25bp重复区25bp重复区AmpRpBR322pGV3850Intermediatevectors•AsmallportionofT-DNAwassubclonedinaconventionalE.coliplasmidvector(i.e.pBR322)foreasymanipulation,producingintermediatevectors•IntermediatevectorsareincapableofreplicationinA.tumefaciensandalsolackconjugationfunctions.•Transferofthemwasachievedusingatriparentalmating.Triparentalmating•AnE.colistrainAcarryingahelperplasmidabletomobilizetheintermediatevectorintrans•TheE.colistrainBcarryingtherecombinantintermediatevector•A.tumefacienscarryingthedisarmedTiplasmid3.Binaryvector•T-DNAdoesnotneedtobephysicallyattachedtotherestoftheTiplasmid•UseseparateplasmidstosupplythedisarmedT-DNAandthevirulencefunctionsPnosKanTnosPcaMVGUSTnospBI121Kanr（）13kbVirpAL4404170kbThesmallplasmidcanbeusedtoinsertedforeigngeneWhenthetwoplasmidspresenttogetherinthesameA.tumefacienscell,theT-DNAcarriedbypBI121istransferredtotheplantchromosomalDNAbyproteinscodedbygenescarriedbypAL4404Ti质粒及其衍生载体Ti质粒是约200-500kb的环状DNA分子，很难直接使用，故需对其加以改造，构建出Ti质粒的衍生载体系统，广泛用作植物基因工程中的载体：（1）双元载体(binaryvectors）如pBin19载体，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作为细菌选择标记，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作为植物的选择标记，pUC19的多克隆位点及α-互补显色标记（2）共整合载体(integratedvectors)（1）双元载体系统（binaryvector）具有两个质粒——穿梭质粒和Ti质粒。（2）共整合载体（integratedvector）共整合载体系统包括在T-DNA上的激素合成区经过突变后的Ti质粒和中间载体两部分。Ti质粒的衍生载体发根农杆菌存在另一种质粒，Ri质粒。Ri质粒也可完成外源基因向植物的转移工作。发根农杆菌侵染后植物细胞产生许多不定根，这种不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称之为毛状根，也称为发状根，分别简称为毛根或发根，Ri质粒为根诱导质粒。Ri质粒的结构与Ti质粒的结构很相似，可以分为T区、vir区、ori区和其它区域等几个部分。Ri质粒T区与Ti质粒的T-DNA十分相似：①T区的左右边界序列。左右边界上含有25bp的重复序列。②TL-DNA区。该区中含有与毛状根形成有关的rolA、B、C、D基因群。③TR-DNA区。该区中含有与农杆碱合成有关的基因（ags）和生长素合成有关的基因（tms1、tms2）。ags基因在转化的初期起着重要的作用，是不定根产生的关键Ri质粒CaMV克隆载体•含1个约8kb的环状双链DNA分子；•用于十字花科和少数非十字花科的植物基因转移；•其感染对植物有害，不能直接做载体；•CaMV的DNA在植物细胞中能高水平转录35SRNA，其启动子是一强启动子。构建的含35S启动子的系列克隆载体可在植物细胞内高效表达基因。三、动物载体质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40（SimianVirus40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等。猴病毒40（SV40）的基因组常用来作为克隆载体，把外源DNA转入哺乳类细胞。猴病毒40是球形动物病毒，直径40nm，呈20面体，有一个共价闭环的双链DNA基因组，全长5244bp。它在猴肾中增殖。被SV40感染的细胞都会出现SV40的T抗原