华勃氏呼吸计法测定L-谷氨酸-biolabdlilied

华勃氏呼吸计法测定L-谷氨酸实验目的了解华勃氏呼吸仪测定气体变化的原理。掌握华勃氏呼吸仪测定气体变化的具体操作。实验原理华勃氏呼吸计法基本原理是在一密闭的、定温定体积的系统中进行样品气体变化的测定。当气体被吸收时，反应瓶中气体分子减少，压力降低；反之，产生气体时，压力则上升，此压力的变化可在测压计上表现出来，由此可利用气体定律计算出产生的CO2或吸收O2的量。此法可用于细胞、线粒体等耗氧速率和发酵作用的测定，也可进行研究其他有关和O2和CO2气体交换反应，如呼吸作用、光合作用、脱羧酶和氧化酶的活性等。大肠杆菌菌体内含有L-谷氨酸脱羧酶，能专一地催化L-谷氨酸脱羧，释放出二氧化碳。利用华勃氏呼吸仪测定并计算出二氧化碳量后，可进一步求出L-谷氨酸含量。仪器、原料和试剂仪器：移液管2ml、0.5ml、0.2ml、0.1ml；2ml注射器；瓦氏呼吸仪1套。原料：（1）大肠杆菌-丙酮粉的制备：将纯化的大肠杆菌由试管斜面培养接种到10支200ml茄形瓶培养基上，于37℃培养16～18h。（2）培养基的配方如下：蛋白：10g牛肉膏浓缩液：5g琼脂：20g蒸馏水：1000ml每一茄形瓶加入少量0.9%氯化钠溶液，洗下菌体（可洗二次），菌体悬液离心（2500r/min）弃去上清夜，沉淀（菌体）悬浮于少量生理盐水中，置冰箱中冷却至20℃。向已冷却的菌体悬液中加入10倍体积的冷丙酮（-10℃），边加边搅拌10min，静置，待菌体沉淀后，倾去上清夜，菌体用布氏漏斗抽滤，并用冷丙酮洗菌体1～２次，滤液置于干燥器内减压干燥，所得大肠杆菌-丙酮粉装于密封瓶内，冰箱保存，数日内有效（现制备的要放入冰箱40h后，取出研磨粉备用）试剂：①乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.0）：A液：3mol/L乙酸钠溶液。称取CH3COONa•3H2O（相对分子量136.09）40.8g溶于蒸馏水中，然后定容至100ml。B液：2mol/L乙酸溶液。称取12g乙酸加蒸馏水定容至100ml。将A、B两液按7：3（体积比）混合即得，使用时事先用pH计校正。②0.5mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.0）：称取30g冰乙酸加入12gCH3COONa•3H2O，溶解后放入100ml定量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。也可用3mol/L乙酸缓冲液稀释制得。③2%大肠杆菌-脱羧酶液：称取2g大肠杆菌-脱羧酶-丙酮粉，用pH5.00.5mol/L的乙酸缓冲液定容至100mL。④0.05mol/LL-谷氨酸溶液：准确称取L-谷氨酸0.7360g，用蒸馏水定容至100ml。⑤检压液（或称布洛的氏溶液）：称取NaCl23g，牛胆酸钠5g，伊文氏蓝0.1g（相对分子质量960.83）（如没有，可以用0.1g甲基蓝或酸性品红代替）。混合后再加麝香草酚蓝酒精溶液数滴（防腐）（1g麝香草酚蓝溶于100ml40%酒精中），用蒸馏水定容至500ml，相对密度为1.033，使用前需校正，若相对密度高于1.033时用蒸馏水调，低时用NaCl调。实验步骤1．将测压管固定于铁架上，放松螺旋压板，用注射器在橡皮管内加入检压液至刻度50mm处。2．按下表在反应瓶中加入各试剂。反应瓶侧管瓶塞和压力计三通塞均涂以凡士林后塞紧。压力计口亦涂上凡士林和反应瓶连接，轻轻转动反应瓶，使封口凡士林呈透明，然后用橡皮筋将反应瓶固定在压力计上。编号项目反应瓶主室反应瓶侧室乙酸-乙酸钠溶液0.05mol/LL-谷酸钠蒸馏水酶液1对照0.2ml02ml0.3ml2样品0.2ml0.11.9ml0.3ml3．在水箱内加入温水至水箱上部6cm处，调节水银触点温度计至37℃。打开电源开关和加热开关，升温至酶反应温度37℃。4．将两副压力计固定在水槽上，使反应瓶进入水浴中。保温振荡10min（120转/min），当反应瓶内温度与水槽温度平衡后，关闭三通活塞，调节螺旋夹，使左右两侧检测液面高度不同（左侧开口端液面约在230mm处），记录液面高度，10min后检查液面是否发生变化。如无变化，表示测压计不漏气，可以开始测定。5．转动三通活塞，使与大气相通，调节螺旋夹，使右侧（闭管，但此时与大气相通）管内液面在150mm处（参比点），记录左侧（开口端）液面高度，此为反应前读数，关闭三通活塞。6．用左手食指堵住测压管左侧口，取出测压装置，将反应瓶侧室中的酶液倾入主室中，摇匀（注意勿使液体堵住气体出口），立即放回水槽中，并放开食指，将右管液面调节在150mm处。7．开始振荡15min后，将压力计的右管液面调至150mm处，记录测压计左管液面高度，继续再振荡几分钟，重复将压力计的右管液面调至150mm处，记录测压计左管液面高度，当读数不再变化时的读数为终读数。8．测量完成后先打开压力计三通活塞，再取下压力计和反应瓶。关闭仪器的各个开关。计算L-谷氨酸含量=[（ΔV×147130）/22400000]×10×n（mg/mL）=（ΔV/152）×10×nΔV=Δh2×K2-Δh1×K1Δh2=h2-h1,Δh1=h2-h1式中h1--样品瓶初读数，mm液柱；h2—样品瓶终读数，mm液柱；h1’—对照瓶初读数，mm液柱；h2’—对照瓶终读数，mm液柱；K1—样品反应瓶常数，μL/mm液柱；K2—样品反应瓶常数，μL/mm液柱；n—样品稀释倍数；10—0.1ml样品换算成1ml；147130—谷氨酸的摩尔质量（ml/mol）；2240000—1mol谷氨酸脱羧放出CO2的体积（μL）（标准情况下）注意事项检压液注射时要避免液柱内产生气泡。反应瓶与测压管是配套的，使用时勿弄错。思考题华勃氏呼吸计的测定原理是什么？实验过程中为减少实验误差需要注意哪些操作？