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基因工程教学大纲geneticengineering2《基因工程》教学大纲课程名称：基因工程课程类型：范围选修学时：48学时适用对象：生命类专业先修课程：《生物化学》、《分子生物学》、《遗传学》、《微生物学》一、课程性质、目的与任务以及对先修课程要求基因工程技术是现代生物技术的核心技术，系统学习作为生物工程核心的基因工程可为众多课程的学习打下良好的基础，是生命学科的一门专业选修课。要求学生能较全面和深入理解基因工程原理，并了解生命科学研究的设计思路和基因操作技术平台的应用策略。以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的理论基础。本课程涉及到生物学的一些重要课程，如：普通生物学、生物化学、微生物学、遗传学和分子生物学，因此要学生选修这些课程之后，再选修本课程。二、教学重点、难点教学重点：本课程的理论课程的讲授侧重于基因工程操作的基本原理，而不是基因操作的实验，这是本课程内容安排的基本准则。课程主要是基因操作的基本原理，包括基因概念的发展、工具酶、载体、体外重组、外源基因的导入和筛选鉴定等。教学难点：在讲授基因工程原理的同时，竭力与分子遗传学、细胞生物学、生物化学、分子生物学等赖以发展的学科和相关原理有机地结合起来，开阔学生视野，对生命科学的的基础知识融会贯通，做到理论与应用相结合。三、与其他课程关系基因工程是在《生物化学》，《分子生物学》等课程基础上开设的一门专业课；同时为后续的《功能基因组》、《生物芯片》、《生物信息学》打下基础。本课程的学习对全面掌握生物技术各专业基础课的内容具有重要作用，为进一步了解现代生物技术领域的内容具有重要促进作用。四、教学内容、学时分配及基本要求第一章绪论（4学时）基本要求：掌握基因工程技术的基本概念、基本原理以及基本过程，了解基因工程的发展历史以及研究意义，主要是基因工程的诞生和成熟；掌握基因的现代概念，并理解基因与基因工程之间的关系。重点：遗传工程、基因工程的概念；基因工程理论上的三大发现和技术上的三大发现；基因工程的基本步骤；基因工程的意义。难点：基因工程的概念；基因工程的基本步骤；基因工程的基本原理。3第一节基因与基因工程的关系1.1基因与基因工程的关系1.2基因的现代概念第二节基因工程的主要研究内容及应用2.1基因工程的定义及其理论基础2.2基因工程技术的诞生及其发展史2.3基因工程的基本程序2.4基因工程的应用第二章基因操作的主要技术原理（10学时）基本要求：掌握基因的分子克隆等基本技术的概念，以及重组体的概念和其鉴定方法，了解其方法的基本原理和基本操作步骤，最主要的是基因的分子克隆技术。重点：电泳、PCR、杂交、测序的基本原理和操作步骤。难点：PCR的应用；DNA与蛋白质的相互作用。第一节核酸凝胶电泳1.1电泳技术原理1.2琼脂糖凝胶电泳1.3脉冲场凝胶电泳1.4聚丙烯酰胺凝胶电泳第二节PCR原理2.1PCR技术的基本原理2.2PCR反应的各种组份及作用2.3不对称PCR(AsymmetricalPCR)2.4反向PCR（inversePCR）2.5反转录PCR（RT-PCR）2.6基因组克隆2.7基因的体外诱变2.8基因组的比较研究第三节核酸分子杂交3.1核酸杂交的基本原理3.2常用的杂交膜3.3SouthernDNA杂交技术3.4NorthernDNA吸印杂交技术3.5斑点印迹杂交和狭线印迹杂交3.6菌落及噬菌体杂交技术43.7凝胶阻滞实验3.8DNaseⅠ足迹实验3.9硫酸二甲酯（DMS）足迹实验3.10甲基化干扰实验3.11体内足迹实验第四节DNA的序列分析4.1Sanger双脱氧链终止法4.2化学法测序4.3杂交测序4.4shot-gun测序第三章基因工程的酶学基础（6学时）基本要求：通过本章的学习，熟悉基因工程中所使用的各种工具酶，并能在实际操作中运用它们。重点知识：同位酶；同裂酶；同尾酶；DNA操作酶的功能及应用（S1核酸酶，DNaseI,测序酶，DNA连接酶，Ligase,逆转录酶，碱性磷酸酯酶，甲基化酶）；限制性内切酶的分类、命名原则；电泳后DNA的检测方法；DNA分子量的估算方法；怎样提高平头末端的连接效率；如何实现目的基因与载体连接效率；提高重组率的方法。难点知识：DNA操作酶的功能及应用；怎样提高平头末端的连接效率；如何实现目的基因与载体连接效率；提高重组率的方法。第一节限制性内切酶1.1细菌中修饰与限制的现象1.2限制酶的分离与命名1.3限制酶分类1.4Ⅱ型酶特征1.5限制性内切酶反应条件1.6Ⅱ型酶作用机制1.7限制性内切酶的应用第二节连接酶与分子的体外连接2.1DNA连接酶2.2粘性末端DNA片段的连接法2.3平末端DNA片段的连接法2.4同聚物加尾的连接法2.5衔接物连接法2.6接头连接法5第三节聚合酶重点：缺口平移、取代合成法3.1DNA聚合酶Ⅰ与缺口平移技术3.2T4-DNA聚合物与取代合成法3.3逆转录酶与互补DNA的合成3.4T7-DNA聚合物与修饰T7-DNA的聚合酶第四节修饰酶4.1末断脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾4.2T4多核苷酸激酶与DNA分子5’—端标记4.3碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用4.4SI核酸酶第四章基因工程的载体（8学时）基本要求：熟悉基因工程中常用的各种载体，了解它们的特点并能在实际操作中运用它们。掌握作为载体的必备条件。了解载体的构建过程和基本方法。重点：载体；克隆载体；表达载体；穿梭载体；质粒；严谨型质粒松弛型质粒；cos位点；λcI突变体；溶源/溶菌性噬菌体；粘粒（cosmid）；噬菌粒；载体的基本要求；质粒的基本特征及其分类；λDNA的特点；M13作为载体的优点；大肠杆菌质粒pBR322、pUC8、pGEM3Z-DNA的特点；不同载体克隆DNA的片段大小；M13、λDNA作为载体需要进行哪些改造？λ克隆载体的类型；YAC载体包括那些结构，来源和构建方法。难点：严谨型质粒松弛型质粒；粘粒（cosmid）；噬菌粒；M13、λDNA作为载体需要进行哪些改造？λ克隆载体的类型；YAC载体包括那些结构，来源和构建方法。第一节质粒载体1.1质粒及其基本特征1.2天然质粒载体：Psc101质粒载体、ColEⅠ质粒载体1.3大肠杆菌中常用的质粒载体：PBR322质粒载体等1.4其它类型的质粒载体1.5质粒载体的稳定性第二节λ噬菌体载体2.1λ-phage的分子生物学2.2λ-phage载体的构建第三节单链DNA噬菌体载体（M13）3.1M13噬菌体的生物学特性3.2M13噬菌体作为载体的优点63.3M13噬菌体载体的构建第四节噬菌粒载体第五节cosmid载体第六节其他载体6.1YAC6.2BAC6.3PAC第五章基因的分离与鉴定（10学时）基本要求：掌握DNA克隆片段产生与分离的方法、重组体DNA分子构建的过程、重组体分子导入受体细胞的方法和重组体分子选择与鉴定的方法。重点：部分酶切；转化的方法有哪些？基因文库；cDNA文库；克隆基因的方法有哪些；克隆所使用探针的来源；；如何从基因文库中克隆目的基因？感受态细胞；插入失活；α-互补；Spi+；噬菌体DNA转化大肠杆菌的方法；重组噬菌斑的鉴定方法；重组DNA的鉴定方法。难点：基因文库；cDNA文库；克隆基因的方法有哪些；如何从基因文库中克隆目的基因？建生物基因组文库需要克隆的数目；α-互补；噬菌体DNA转化大肠杆菌的方法；重组噬菌斑的鉴定方法；重组DNA的鉴定方法。第一节DNA克隆片段的产生与分离1.1获得外源基因的途径1.2基因组DNA的片段化1.3DNA片段大小的分离1.4编码目的基因的克隆片段的富集第二节重组体DNA分子的构建及导入受体细胞2.1原核生物的转化2.2真核生物的转化第三节基因克隆的实验方案3.1基因文库3.2CDNA基因克隆3.3基因组DNA克隆3.4基因定位克隆的概念3.5RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)分子标记3.6RFLP作图的原理与步骤3.7大尺度基因组物理图谱的构建7第四节克隆基因的分离4.1应用核酸探针分离克隆的目的基因4.2应用差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因4.3应用表达文库分离克隆的目的基因4.4应用mRNA差别显示技术分离克隆的目的基因4.5酵母双杂交体系分离克隆的目的基因第五节重组子的选择与鉴定5.1遗传学检测法5.2物理筛选法5.3核酸杂交筛选法5.4免疫化学筛选法第六章真核基因在大肠杆菌中的表达（4学时；2学时课后自学）基本要求：掌握外源基因表达条件及影响表达的因素，大肠杆菌基因表达系统；了解基因表达产物的检测方法；掌握表达载体、融合基因、融合蛋白的概念；掌握大肠杆菌基因表达载体构建的基本元件；掌握功能启动子分离的方法。重点：大肠杆菌基因表达载体构建的基因元件及常见大肠杆菌基因表达系统，基因融合的策略及其优点难点：外源基因在大肠杆菌中表达的基本条件、常用表达载体及提高表达的措施。第一节真核基因的大肠杆菌表达体系1.1大肠杆菌表达体系1.2克隆基因正确表达的基本条件1.3克隆基因表达活性的检测第二节大肠杆菌的表达载体2.1表达载体的组成部分（自学）2.2功能启动子的分离2.3常用的大肠杆菌表达载体第三节克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达（自学）3.1外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位3.2融合蛋白质的表达第四节影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素（自学）第七章植物基因工程（4学时）基本要求：掌握转基因植物的概念，植物基因转移的方法与途径;了解植物基因转移的操作过程;了解植物基因工程研究常用的基因。重点：掌握植物基因工程研究常用的基因；转基因植物的概念，植物基因转移的方法。8难点：植物基因转移的途径，转基因植物的研究现状。第一节植物基因的克隆与分离1.1根据基因的功能分离目的基因1.2根据mRNA特异分离目的基因1.3根据DNA的插入作用分离目的基因第二节植物基因工程研究常用的基因2.1选择标记2.2报告基因2.3抗虫基因2.4抗病基因2.5非生物胁迫的抗性基因第三节植物基因转移的病毒载体3.1单链RNA植物病毒3.2双链DNA植物病毒第四节植物基因转移的质粒载体4.1病原土壤杆菌4.2植物冠瘿的诱发与冠瘿细胞的特性4.3Ti质粒的遗传特性4.4T-DNA的结构与功能4.5Ti质粒载体第五节植物基因转化方法5.1生物转化5.2花粉管通道法5.3脂质体转化5.4电击法第六节转基因植物的检测鉴定6.1报告基因的表达检测6.2转基因植物的PCR检测6.3外源基因整合杂交鉴定6.4外源基因表达蛋白的检测第八章动物基因工程（4学时）基本要求：掌握反转录病毒载体的特点和应用;了解其他常用的病毒载体的特点和应用;掌握哺乳动物基因转移的方法与途径;了解转基因技术的应用和发展。9重点：反转录病毒载体的特点和应用。难点：哺乳动物基因转移的方法与途径；转基因技术的应用和发展。第一节哺乳动物基因转移的遗传选择标记1.1哺乳动物基因转移的遗传选择标记1.2SV40病毒载体生物学特性及载体1.3重组的病毒-质粒载体第二节哺乳动物的载体系统2.1反转录病毒载体2.2痘苗病毒载体2.3乳头瘤病毒载体2.4腺病毒(Adenoviruses)载第三节转基因导入细胞内的方法3.1物理方法3.2化学方法3.3生物方法第四节转基因动物4.1转基因动物的研究历史4.2转基因技术的应用及发展五、主要参考书1.《基因工程原理》吴乃虎科学出版社20012.《基因工程概论》张惠展华东理工大学出版社19993.《基因工程》楼士林科学出版社20024.《基因工程》杨汝德华南理工大学出版社20035.《分子克隆实验指南(第三版)》萨姆布鲁克J.科学出版社20026.《基因工程学原理》马建岗西安交大出版社20017．《途径工程—第三代基因工程》张惠展中国轻工业出版社20028.《GeneⅧ》BenjaminOxfordUniversityPress2004六、课程的考核方式及方法考试的基本要求：笔试、闭卷（A/B卷）考试目的：测评学生对基因工程基本原理和方法的掌握程度，以及运用基因工程基本原理和方法设计实验解决实际问题的