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第九章发酵工程下游技术发展及发酵液的预处理•下游技术（工程）：对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。概述下游加工过程的重要性。（组成、费用和关注程度）•1.组成：下游加工过程是生物技术的重要组成部分，发酵液或反应液需要经过下游加工过程才能成为成品；•2.费用：传统发酵工业中下游部分的费用占整个工厂投资费用的60％，而对重组DNA生产蛋白质等基因工程产品，下游加工的费用可占整个生产费用的80％－90％；•3.关注程度：英国政府工业部于1983年发起生物分离计划（BIOSEP），专门研究下游加工过程；1987年英国化学工业会召开了专门讨论下游加工过程的国际会议；我国也于1989年在济南召开了一次专门会议；近十年来国内外有关生物分离或蛋白质纯化的专著陆续出版。第一节发酵工程下游技术发展一、发酵产物的分类•从工业发酵范畴来看，从发酵液中获得的发酵产物大致可分为三类：–1、菌体：–2、酶：–3、代谢产物二、下游加工技术的特点•1.发酵液的复杂性造成分离上的困难性。•粗原料中带入大量的不参与发酵过程的可溶性杂质和不溶性悬浮物，给下游过程的分离提取带来了不小的困难，增加了下游操作成本，包括发酵废液的处理成本•2.欲提取的产物通常浓度低且很不稳定。一些新兴生物技术产品，待处理物料中产品浓度很低，往往低于杂质含量，如L—异亮氨酸为2.4％，青霉素为3.6％，每千克产品中核黄素仅含几克、胰岛素仅含几十毫克，而且对热、PH、有些甚至对光不稳定。生物活性物质的活性还易受温度、pH、金属离子、无机盐浓度、有机溶媒等环境因素的影响。制约了下游技术的可选范围。•3.多为分批操作，各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一定弹性。四、生物工业下游技术的发展历程2.纯培养阶段古代酿造业包括酿酒、制酱（油）、醋、酸奶和干酪等。技术原始、家庭式作坊、产物基本不经过后处理而直接使用，无下游技术。主要指1860－1930。发现了发酵的本质是微生物的作用，掌握了纯种培养技术，生物技术进入近代酿造产业的发展阶段。逐渐开发形成了发酵法生产酒精、丙酮、丁醇等微生物发酵工业（厌氧发酵），其产品相对简单，基本上是无活性的小分子。此时开始引入过滤、蒸馏、精馏等近代分离技术。1.古代酿造业以20世纪40年代出现的青霉素产品为代表。无菌空气制备技术、大型好氧发酵装置开发，一大批通风发酵技术产品相继投入了工业生产，如抗生素（链霉素）、氨基酸（谷氨酸）、有机酸（核酸、柠檬酸）、酶制剂（淀粉酶）、微生物多糖和单细胞蛋白等。产品多样性决定了分离方法的多样性。借鉴和引进吸收了大量的近代化学工业的分离技术，如沉淀、离子交换、萃取、结晶等。3.液体深层发酵阶段以20世纪70年代末崛起的DNA重组技术及细胞融合技术为代表。生物技术在其主要领域：基因工程、酶工程、细胞工程和发酵工程取得了长足进步，一批高附加值的产品开始面世，如乙肝疫苗、干扰素、功能因子、低聚糖、活性肽、高度不饱和脂肪酸等。生物技术在深度和广度上都取得了很大的进展。很多企业开始加强在生物工业下游技术领域的研究开发力量，不断推出新技术、新产品、新装备，以抢占更多的市场。新技术有超临界CO2萃取技术、膜过滤、渗透蒸发技术、各种色谱（层析）技术等。4.现代生物技术阶段20世纪80年代以来，生物工业下游技术进步很快，出现了很多新概念、新技术、新产品和新装备。大致可分为以下几大类：（1）固液分离技术絮凝技术引入到发酵液的预处理上，研究开发了菌体及悬浮物絮凝技术，改善了发酵液的分离性能，加之纤维素助滤剂的开发，大大提高了发酵液的固液分离效率。在固液分离机械方面，也出现了一些性能优良的新型机械，如带式过滤机、板框过滤机、螺旋沉降式离心机等。微滤膜可高效分离细微的悬浮粒子。已开发出珠磨破碎、高压匀浆法、X-press法和化学破碎等技术。该技术的成熟使得胞内代谢产物的大规模工业化生产成为可能。（2）细胞破碎技术主要开发了沉淀、离子交换、萃取、超滤等技术。较早出现的是酶及蛋白质的盐析法；有机溶剂沉淀法；双水相萃取技术比较适合于胞内活性物质和细胞碎片的分离；超滤技术解决了生物大分子对pH、热、有机溶剂、金属离子敏感等难题，在生物大分子的分级、浓缩、脱盐等操作中得到了广泛的使用。（3）初步分离纯化技术小分子物质一般可通过离子交换、脱色和结晶、重结晶等方法获得纯度很高的产品。生物大分子的纯化一直是个难题。20世纪70年代以来，逐渐开发出各种色谱（层析）技术，如亲和色谱、疏水色谱、聚焦色谱、离子交换色谱和凝胶色谱等，后两种技术已开始用于批量生产。（4）高度分离纯化技术（5）其他新型分离技术超临界CO2萃取技术在获得天然生物物质方面有着独特的优势。20世纪80年代以来，已经在许多领域中迅速实现了工业化。如啤酒花中有效成分和咖啡豆中咖啡因的萃取分离。介于反渗透和超滤之间的纳米滤技术，由于其能使水和大部分无机盐通过而截留分子量300-1000的小分子有机物，且操作压力低，在生物工业和水处理中具有广阔的应用前景。渗透蒸发技术、液膜技术及反胶团技术的研究和应用开发等也相继取得了很大的进展。五、发酵工业下游技术的一般工艺过程•下游加工过程由各种化工单元操作组成。由于生物产品品种多，性质各异，故用到的单元操作很多，其中如蒸馏、萃取、结晶、吸附、蒸发和干燥等属传统的单元操作，理论比较成熟，而另一些则为新近发展起来的单元操作，如细胞破碎、膜分离和色层分离等，缺乏完整的理论，介于两者之间的有离子交换过程等。1.一般工艺过程•一般说来，下游加工过程可分为4个阶段：•（1）预处理和固液分离：目的是除去发酵液中的菌体细胞和不溶性固体杂质（离心和过滤）。•（2）初步分离：目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为后道精制工序创造有利条件（萃取、吸附、沉淀、蒸发）•（3）高度纯化：去除与产物的物理化学性质比较接近的杂质（层析、膜分离、离子交换、沉淀、电泳）。•（4）产品的最后加工：成品形式由产品的最终用途决定（结晶、干燥、蒸馏）。下游加工一般工艺流程发酵液菌体提取、分离纯化、精制产物胞外产物胞内产物离心或过滤细胞破碎离心或过滤离心或过滤干燥含产物的清液离心或过滤干燥产物固体部分下游工艺过程决定于产品的性质和要求达到的纯度•如产品为菌体本身，则工艺比较简单，只需经过滤、得到菌体，再经干燥就可，如单细胞蛋白的生产。•如可以从发酵液直接提取，则可省去固液分离步骤。•如为胞外产物则可省去细胞破碎步骤。2.如何着手对一种未知的发酵产品进行提取。•（1）产品的类型，性质的研究。大致确定它是属于哪一类型；了解它是一种成分还是几种成分的混合物。•（2）稳定性研究。确定在哪一种条件下进行提取和精制不受破坏，即确定提取条件。适合于大规模工业化生产的传统技术经过改造提高后，适应面更宽，效率会更高，仍然显示出强劲的生命力。各种新型高效的过滤机械和离心机械的问世，结晶理论和离子交换技术的新进展，提高了产品的收率、质量和生产效率。六、生物工业下游技术的发展动态——成本、质量、环保将是该技术发展方向和动力1.传统分离技术的提高和完善2.新技术的研究开发膜（膜材料和膜制造工艺）、树脂（离子交换树脂和大网格树脂）和凝胶（琼脂糖凝胶为基质，与各种配基结合后制成各种色谱分离介质）是目前主要的新型分离介质。各种分离纯化技术相互结合、交叉、渗透，形成子代分离技术。如膜技术和萃取、蒸馏、蒸发技术相结合形成了膜萃取技术、膜蒸馏及渗透蒸发技术；色谱技术与离子交换技术等结合形成了离子交换色谱、等电聚焦色谱等。（1）新型分离介质的研究开发（2）子代分离技术（3）其他新兴下游技术由溶剂萃取技术衍生出一大批生物工业分离技术，如双水相萃取、超临界CO2萃取、反胶团萃取（细胞碎片去除、细胞胞内物质、酶及蛋白质、天然生物物质的提取分离）；菌体絮凝技术和菌体细胞破碎技术的进展为工业化经济的分离菌体细胞和大规模生产胞内物质创造了技术前提。第二节发酵液的预处理•一、发酵液的一般特征•1.含水量高，一般可达90％-99%•2.产品浓度低•3.悬浮物颗粒小，密度与液体相差不大•4.固体粒子可压缩性大•5.液体黏度大•6.产物性质不稳定二、发酵液预处理的目的和要求•1.预处理的目的：•（1）改变发酵液的物理性质，促进悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率•（2）尽可能使产物转入便于后处理的某一相中（多数是液体）•（3）去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。2.发酵液预处理的要求:•（1）菌体的分离•（2）固体悬浮物的去除•（3）蛋白质的去除•（4）重金属离子的去除•（5）色素、热原质、毒性物质等有机杂质的去除•（6）改变发酵液的性质•（7）调节适宜pH值和温度三、预处理的方法（一）加热法（二）调节悬浮液的pH（三）发酵液的凝聚和絮凝（四）高价无机离子的去除方法（五）杂蛋白质的去除（一）加热法：降低悬浮液的黏度，除去某些杂蛋白，降低悬浮物的最终体积，破坏凝胶状结构、增加滤饼的空隙度。（不适用热敏性的物质）（二）调节悬浮液的pH通过调节发酵液pH到蛋白质的等电点使蛋白质沉淀，同时络合重金属离子；常用的酸化剂有草酸、盐酸、硫酸和磷酸（三）发酵液的凝聚和絮凝机理•电解质将胶体粒子表面上的电荷中和，减少存在于胶体粒子间的静电斥力，使范德华力占优势，这样胶体就会凝聚成较大、较密实的粒子（凝聚），或在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团使之更容易过滤（絮凝）。常用的凝聚方法•在稀溶液中加入电解质以促进凝聚。试剂包括酸、碱、简单电解质和合成的高分子电解质。常用的絮凝剂•聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚胺衍生物、氯化钙、磷酸氢二钠影响絮凝的因素•絮凝剂的添加量•发酵液的pH•絮凝剂的分子量•搅拌转速•搅拌时间絮凝剂添加量对絮凝效果(滤速)的影响料液中，絮凝剂浓度增加有助于架桥充分，但是过多的加量反而会引起吸附饱和，在每个胶粒上形成覆盖层而使胶粒产生再次稳定现象。发酵液pH对絮凝效果的影响溶液pH的变化常会影响离子型絮凝剂中官能团的电离度，从而影响分子链的伸展形态。电离度增大，由于链节上相邻离子基团间的电排斥作用，而使分子链从卷曲状态变为伸展状态，所以架桥能力提高。•絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于过滤速度的提高，还在于能有效地去除杂蛋白质和固体杂质，如菌体、细胞和细胞碎片等，提高了滤液质量（四）高价无机离子的去除方法•钙离子，可用草酸。•镁离子，可用三聚磷酸钠它和镁离子形成可溶性络合物，用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。此法可用于环丝氨酸的提取。•铁离子，可加入黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀。（五）杂蛋白质的去除方法•热变性•沉淀•大幅度改变pH四、发酵液的过滤•微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基成分。过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程。•在过滤操作中，要求滤速快，滤液澄清并且有高的收率。（一）影响过滤速度的因素过滤速度和以下因素有关•菌种。•发酵条件。培养基的组成未用完培养基的数量消泡剂发酵周期菌种对过滤速度影响•真菌的菌丝比较粗大，如青霉菌的菌丝直径可达10μm，发酵液容易过滤，不需特殊处理。其滤渣呈紧密饼状物，很容易从滤布上刮下来，故可采用鼓式真空过滤机过滤。•放线菌发酵液菌丝细而分枝，交织成网络状。如链霉素发酵液菌丝仅0.5~1.0μm左右，还含有很多多糖类物质，粘性强，过滤较困难，一般需经预处理，以凝固蛋白质等胶体。•细菌发酵液的菌体更细小，因此，过滤十分因准，如不用絮凝等方法预处理发酵液，往往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。发酵条件对过滤速度影响•用黄豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源会使过滤困难；•发酵后期加消泡剂或剩余大量末用完的培养基也会使过滤困难。发酵周期对过滤的影响•正确选择发酵终了时间对过滤影响很大。在菌体丝自溶前必须放罐，因为细胞自溶后的分解产物一般很难过滤。有时延长发酵周期虽能使发酵单位有所提高，但严重影响发酵液质量，使色素和胶状杂质增