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第六章植物原生质体培养和体细胞杂交陈观水生命科学学院jimchen7909@163.com13905914445第六章植物原生质体培养和体细胞杂交主要内容：第一节原生质体的分离和纯化第二节原生质体培养第三节植物体细胞杂交学习的目标与要求：掌握植物细胞原生质体培养的意义，了解原生质分离方法，原生质纯化方法和活力测定方法。掌握原生质体融合概念、介绍原生质体融合方法，了解杂种细胞的筛选、鉴定和杂种植株的鉴定方法。植物原生质体培养和体细胞杂交原生质体的概念植物原生质体(protoplast):指将植物细胞壁去掉后得到的裸露的球形细胞原生质体的特性去壁的原生质体容易实现外源遗传物质的导入和吸收。原生质体具有细胞全能性。不同来源的原生质体具有彼此融合的能力。原生质体培养将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，使其再生细胞壁，进行经过培养成完成植株植物原生质体培养和体细胞杂交原生质体植物原生质体培养和体细胞杂交原生质体的生物学意义细胞原生质体酶解体细胞融合遗传转化共培养显微操作基因枪导入原生质体培养细胞培养愈伤组织诱导再生植株植物原生质体培养和体细胞杂交体细胞杂交(somatichybridization)又称为原生质体融合(protoplastfusion),是指在人工控制条件下，不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种细胞，并使之分化再生,形成新物种或新品种的技术。植物原生质体培养和体细胞杂交植物细胞的融合过程植物原生质体培养和体细胞杂交1978年德国科学家梅歇尔斯等人把马铃薯(potato)和番茄(tomato)的原生质体融合获得了体细胞杂种“泡马豆”（pomato)一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离1)材料来源植物幼嫩的叶片无菌实生苗的子叶和下胚轴外植体来源的愈伤组织和悬浮细胞系花粉细胞2)材料的预处理用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离3)酶的种类及酶液配制原生质体分离常用的商品酶一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离4)分离方法原生质体分离的方法机械分离法酶解分离法一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离4)分离方法一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离4)分离方法机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。۩缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。۩优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离4)分离方法酶解分离法：指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。۩常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶[Driselase]）、果胶酶类（果胶酶和离析酶[Macerozyme]）、蜗牛酶和胼胝质酶。一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离4)分离方法酶解分离法۩优点：获得量大，适用广泛。۩缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质会影响所获原生质体的活力一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离4)分离方法酶解分离法一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离4)分离方法Principlestepsinenzymaticisolation一、原生质体的分离和纯化2.原生质体的纯化1)过滤-离心法2)漂浮法3)界面法一、原生质体的分离和纯化2.原生质体的纯化1)过滤-离心法利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。优缺点：纯化原生质体比较简单。由于原生质体沉积于试管底部，造成相互挤压，常引起原生质体的破碎。一、原生质体的分离和纯化2.原生质体的纯化2)漂浮法采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、Percoll、Ficoll），使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法。优点：(1)可以避免分离的原生质体因震荡被组织碎片撞击而破损。(2)所用药品简单，成本低。缺点及补救措施：对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体则不易漂浮。可采用不同浓度和不同离心速度分次漂浮的方法。飘浮法Protoplast一、原生质体的分离和纯化2.原生质体的纯化3)界面法又称不连续梯度法，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。优点：可以收集到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互挤压而破碎。一、原生质体的分离和纯化2.原生质体的纯化加培养基使原生质体密度为104－106/mL原生质体混合液收集滤液去上清洗液重悬原生质体培养基重悬原生质体去上清40-100μm过滤500rpm1-5min500rpm1-5min重复3次500rpm1-5min去上清重复3次一、原生质体的分离和纯化3.原生质体活力测定1)形态识别形态完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常球形，放入低渗溶液中，可正常膨大。一、原生质体的分离和纯化3.原生质体活力测定2)染色法荧光显微镜识别(FDA法)：FDA(fluoresceindiacetate)本身不发荧光也不具有极性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内FDA可以被酯酶裂解，将能发荧光的极性部分释放出来。荧光素则不能自由穿越质膜，在完整的活细胞内积累。使用浓度：0.01%一、原生质体的分离和纯化3.原生质体活力测定2)染色法酚藏花红染色法（0.1%)：酚藏花红能使无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。伊凡蓝(Evan’sblue)染色法(0.025%)：有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取。细胞质环流法和氧电极法一、原生质体的分离和纯化4.影响原生质体数量和活力的因素供试材料的基因型和外植体酶的种类、浓度与酶解时间渗透压稳定剂质膜稳定剂酶解方式pH湿度和光照二、原生质体培养原生质体培养获得有活力的原生质体后，应用合适的方法，在适当的培养条件下，可使原生质体再生出新的细胞壁，接着细胞进行持续分裂形成细胞团，并培养形成愈伤组织或胚状体，分或或发育成苗，最后形成完整的再生植株。原生质体培养的意义建立单细胞无性系用于原生质体融合遗传转化的良好受体多种基础理论研究的实验材料二、原生质体培养1.原生质体培养方法二、原生质体培养1.原生质体培养方法1)液体浅层培养优点：原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。二、原生质体培养1.原生质体培养方法2)固体平板培养优点：使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。缺点：培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。二、原生质体培养1.原生质体培养方法3)液体-固体双层培养法优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。缺点：不易观察细胞的发育过程。二、原生质体培养2.植株再生过程植株(原生质体)再生过程是指分离、纯化的原生质体在适当的培养方法和良好的培养条件下，很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分化出完整植株的过程。细胞壁再生细胞分裂植株再生二、原生质体培养2.植株再生过程细胞壁再生再生所需时间与植物种类和起源细胞的分化程度及生理状态有关。再生过程：先是质膜合成细胞壁主要成分微纤维，然后在质膜表面进行聚合作用，形成多片层的结构，以后在质膜和片层结构之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形成完整的细胞壁。细胞壁再生是细胞分裂的先决条件二、原生质体培养2.植株再生过程细胞分裂植株再生植株再生有两种途径：通过愈伤组织诱导器官形成途径通过诱导胚状体途径二、原生质体培养3.影响原生质体培养的因素材料培养基渗透压稳定剂原生质体的培养密度培养条件二、原生质体培养原生质体的分离培养与植株再生(动画)二、原生质体培养4.原生质体培养的操作实例7a:分离原生质体10天后第1次分裂7b,c:2和3周龄小细胞团7d,e:4和6周龄小愈伤组织7f:转到B5h培养基前8周龄小愈伤组织8a:转到B5H培养基上的小愈伤组织和体细胞胚诱导8b:转到Boi2y培养基上的球形胚8c:转到MS培养基上的子叶期胚以转化为小植株紫花苜蓿叶片原生质体分裂、克隆体的发育及通过体细胞胚再生小植株三、植物体细胞杂交原生质体的分离与培养(动画)三、植物体细胞杂交体细胞杂交两种异源（种、属间）原生质体，在人工控制条件下，相互接触从而发生膜融合，胞质融合和核融合并形成杂种细胞的过程。体细胞杂交的意义实现远缘杂交，形成新的物种创造细胞质杂种培育作物新种质和新品种三、植物体细胞杂交生物种类细胞来源成功年代烟草两个种间苷蓝——青菜大豆——马唐草矮牵牛——龙面花大麦——花生大麦——大豆小麦——矮牵牛油菜——大豆玉米——大豆大豆——野豌豆大麦——蚕豆大豆——草香木犀酵母菌——鸡大豆——烟草大豆——秋水仙番茄——马铃薯叶——叶叶——根愈伤组织——叶叶——花瓣种子——种子叶——悬浮细胞叶——花瓣叶——悬浮细胞叶——悬浮细胞悬浮细胞——悬浮细胞叶——根悬浮细胞——叶原生质体——血红细胞悬浮细胞——叶悬浮细胞——叶叶——根尖1972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972三、植物体细胞杂交1.原生质体融合的类型1)自发融合同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；2)诱发融合指将植物原生质体制备出来后，再加入诱导剂或用其他方法促使两亲本原生质体融合的方法。三、植物体细胞杂交1.原生质体融合的类型(动画)三、植物体细胞杂交2.原生质体融合的方法1)化学诱导融合利用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合的方法。无机盐诱导融合法高pH-高Ca2+诱导融合法PEG诱导融合法PEG-高pH-高Ca2+诱导融合法2)电诱导融合法利用改变电场来诱导原生质体彼此连接成串，再施以瞬间强脉冲使质膜发生可逆性电击穿而使原生质体融合的方法。三、植物体细胞杂交2)电诱导融合法(动画)三、植物体细胞杂交3.体细胞杂种的筛选及再生植株鉴定1)杂种细胞的筛选互补选择法抗性互补选择法营养缺陷型互补选择法生长互补选择法细胞代谢互补选择法机械选择法2)再生植株的鉴定形态学鉴定、细胞学鉴定、同工酶鉴定、分子生物学鉴定三、植物体细胞杂交4.体细胞杂交应用举例(1)(1)(2)(3)(4)(5)杂种植株融合的原生质体AB再生出细胞壁脱分化愈伤组织再分化植物细胞的融合植物组织培养植物细胞A原生质体B原生质体A杂种细胞AB去壁去壁人工诱导方法？促进融合的方法？融合完成的标志植物细胞B三、植物体细胞杂交思考题1、说明机械分离法和酶分离法的特点2、原生质体纯化方法有哪些？原生质体活力的测定方法有哪些？3、简述原生质体五种培养方法及特点4、原生质体融合有哪几种方法？