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TSA联合基因工程腺病毒H101治疗人食管癌裸鼠皮下移植瘤的研究冯婷1刘霞1董子明#1#通讯作者：男54岁教授博士研究生导师研究方向：病理与病理生理学Email：dongziming@zzu.edu.cn（1郑州大学基础医学院病理生理教研室河南郑州450052）摘要目的：研究TSA药物对基因工程腺病毒H101杀伤食管癌EC9706细胞作用的影响，探讨HDAC抑制剂在腺病毒载体基因治疗中应用的可能性和作用机制。方法：①先成瘤后治疗组，构建裸鼠食管癌移植瘤模型，待肿瘤长出1W后，分组：TSA治疗组（瘤内注射1.0µmol/LTSA/只/次），H101治疗组（瘤内注射50×108vp/d），TSA联合H101治疗组即先注射TSA，第二天注射H101，注射剂量同上。另设空白对照组，以上治疗持续两周，治疗结束取瘤组织检测。②先处理后成瘤组分别采用浓度为4.0μmol/LTSA体外处理EC906细胞48h，浓度200×108vp/dH101处理EC9706细胞48h，及二者联合处理EC9706细胞48h，同样设置空白对照组，将处理后的细胞种植于裸鼠皮下构建裸鼠食管癌移植瘤模型。待瘤体长出2周后，取瘤组织用RealTimePCR、Western-bioting和免疫组化法检测CAR在移植瘤中的表达，测量肿瘤体积。结果：无论是先处理后成瘤组还是先成瘤后治疗组，TSA组和TSA联合H101治疗组均可上调裸鼠食管癌移植瘤组织中CAR蛋白的表达，相比与对照组和H101治疗组均有明显差异(P0.05)，但TSA组和TSA联合H101治疗组之间相比差异无显著性(P0.05)。而对人食管癌EC9706细胞裸鼠皮下移植瘤大小影响TSA联合H101治疗组与TSA组、H101单独治疗组相比均有明显差异(P0.05),TSA和H101组相比差异无显著性(P0.05)。各治疗组与空白对照组相比，差异均有统计学意义(P0.05)。结论：TSA能增强H101治疗人食管癌裸鼠皮下移植瘤，其作用机制是TSA上调了食管癌CAR蛋白的表达。关键词：柯萨奇-腺病毒受体（Coxsackieandadenovirusreceptor，CAR)；TrichostatinA（TSA)；基因工程腺病毒；EC9706；裸鼠[中图分类号]：R735.1；R730.231[文献标识码]：ATSAcombinedgeneticallyengineeredadenovirusH101fortreatmentoftumortissueofnudemicetransplantedwithhumanesophagealcancercellsfengting1liuxia1dongziming1#DepartmentofPathophysiology,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China[ABSTRACT]Objective：thestudyistoobserveTSAdrugfortheeffectofgeneticengineeringadenovirusH101killingesophagealcancerEC9706cell,anddiscusstheactionmechanismsandthepossibleapplicationsofHDACinhibitorinadenovirusvectorsforgenetherapy.Methods:①thefirstexaminationistreatmentaftergrowingtumour.theexaminationfollowingisbuildingnudemodeloftransplantedtumorinesophagealcancer,andgroupingwhenthetumorgrowingoneweek.TSAtreatmentgroup(injectionTSA1.0μmol/LTSA/only/time);H101treatmentgroup(injectionH10150×108vp/d);TSAandH101treatmentgroup,thefisttoinjectTSA,andthenextdaytoinjectH101,theinjectiondosageasabove.anothergroupismatchedgroup.Obtainingtumortissueaftertreatingtwoweeks.②thesectionexaminationistreatmentbeforegrowingtumour.onegroupisutilizingtheconcentrationof4.0μmol/LTSAtotreatEC906cells48h,tnesecondgroupisutilizingtheconcentrationof200×108vp/dH101totreatEC9706cells,48h,tnethirdgroupisthetwodrugsinjoinedtotreatEC9706cells48h,anothergroupismatchedgroup.thetreatedcellsgrownundernskinofnudemicetobuiltxenograftmodelofesophagealcancer.Aftertwoweeks,obtainingthetumortissuesandusingRealTimePCR,Western-biotingandimmunohistochemistrytodetectexpressionofCARinthetumorandmeasuretumorvolume.Results:.Whetherthefirstexaminationoftumororthesectionexamination,compareingthematchedgroupandonlyH101treatmentgroup,TSAtreatmentgroupandTSAassociatingwithH101treatmentgroupabletorisetheexpressionofCARproteininesophagealcancexenografttissueinnudemice(P0.05).ButtheTSAgroupandtheTSAcombinedH101groupwerenosignificantdifference(P0.05).buttheTSAcombinedH101grouptothehumanesophagealcancerEC9706cellsinnudemice,comparedwithH101orTSAgroup,wasallsignificantdifference(P0.05),Eachtreatmentgroupandblankcontrolgroup,thedifferenceswerestatisticallysignificant(P0.05).Conclusion:TSAcanenhancetheH101treatingnudemicesubcutaneoutransplantedtumorofhumanesophagealcarcinoma.Moreove,thecombinedTSAandH101drughasabesttherapy.ThemechanismpossibllyisTSAincreasingtheexpressionofCARproteininesophagealcarcinoma.[KEYWORDS]：Coxsackieandadenovirusreceptor，CAR；TrichostatinA（TSA)；GeneticallyModifiedAdenovirus；Nude随着基因治疗理论和技术的发展，腺病毒作为溶瘤病毒或基因治疗的载体已应用于恶性肿瘤的治疗，复制选择性腺病毒(Replication-selectiveadenoviruses)以其独特的优势成为肿瘤病毒治疗研究最为广泛的病毒热点之一，通过遗传工程改造后使其能够通过特异性在肿瘤细胞中复制、裂解肿瘤细胞，而对正常的细胞无杀伤力。目前已成功构建了多种溶瘤腺病毒1-2。H101就是其中一种溶瘤病毒药物，它是利用了基因重组删除了人5型腺病毒E1B部分基因片段所构建的。但在很多研究中表明：H101作为单一的治疗剂效果并不明显，而且在不同肿瘤中治疗效果存在显著差异3-4。临床研究表明，造成这种差异的原因是受到组织器官表达柯萨奇病毒腺病毒受体的影响。而组氨酸去乙酰化酶（Histonedeacetylase，HDAC)是最近研究最多的抗肿瘤药物，它可以调节肿瘤的分化、迁移、转移和血管生成。已有研究表明，它的抑制剂TSA对肿瘤组织CAR的表达有影响。那么TSA药物联合H101药物能否提高溶瘤效应？我们用TSA、H101、以及TSA联合H101分别治疗人食管癌裸鼠皮下移植瘤，在动物体内来验证TSA能否可以增强基工程腺病毒H10以治疗人食管癌裸鼠皮下移植瘤，其作用机制是TSA上调食管癌柯萨奇-腺病毒受体（CAR）的表达。1材料与方法1.1材料食管癌细胞由郑州大学基础医学院病生教研室提供，RPMI-1640培养基购自美国HyClone公司；胎牛血清购于杭州赛乐生物科技有限公司；胰蛋白酶购于美国Hykelone公司；免疫组化SP试剂盒购于北京中杉金桥公司；RT-PCR试剂盒（TaKaRa公司）；总RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司；琼脂糖（BIOBASIC公司）；兔抗人CAR和Action单克隆抗体购自美国SantaCruz，TSA购买Sigma（USA）公司，BALB/C裸小鼠，雌性，鼠龄4W，体质量18g-22g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。1.2实验方法1.2.1食管癌EC9706细胞的培养：食管癌EC9706细胞于RPMI-1640培养液（含10﹪胎牛血清，青霉素100u/ml，链霉素100u/ml），37℃、5%CO2孵箱内贴壁培养。1.2.2食管癌移植瘤模型的建立和分组：①先成瘤后治疗组：培养EC9706细胞，经胰酶消化后离心，用PBS液清洗2次；调整细胞浓度为1×107ml,接种于裸鼠左上肢皮下，于肿瘤长至8mm×7mm后分为4组。A组：腹腔注射PBS代替药物。B组：腹腔注射H10150×108vp/d/只/次。C组：1.0µmol/LTSA/只/次。D组：联合应用TSA和H101，先注射TSA，第二天注射H101，注射剂量分别同B组、C组。以上各组治疗连续2W，治疗结束，取瘤组织。②先处理细胞后成瘤，分为4组，每组5只。A′组：细胞不作任何处理。B′组：采用浓度为200×108vp/dH101处理细胞48h。C′组：采用浓度为4.0μmol/LTSA的处理细胞48h.D′组：TSA和H101联合处理细胞，TSA作用细胞24h后，再用H101，浓度同B′、C′组。然后将各组细胞分组种植于裸鼠左上肢皮下构建裸鼠食管癌移植，待肿瘤长出2周后，取瘤组织。1.2.3裸鼠移植肿瘤体积测量:裸鼠处死后,剥离肿瘤,用游标卡尺测量肿瘤最长径及最短径(mm),肿瘤体积V(mm)=π×最长径×最短径2/6.1.2.4免疫组化检测CAR的表达:严格采用免疫组化SP法试剂盒进行检测,随机挑选裸鼠制作组织切片；将封闭好的切片用PBS洗涤3min×3次；用5%的正常羊血清于室温下封闭非特异性抗原15min；弃去多余的血清,滴加适当稀释的一抗(1：50)，在湿盒内4℃冰箱过夜，隔日室温复温1h后用PBS洗涤3min×3次,滴加适当二抗（1:200）孵育30min。阴性对照用PBS代替一抗。显色、脱水、封片。1.2.5：免疫组化结果判断：采用高清晰图像处理系统，随机取5个高倍视野进行定量分析，对免疫组化检测CAR蛋白阳性信号面积