酶的固定化技术

主要内容为什么要固定化什么叫做固定化如何固定固定化的酶活力测量固定化酶的特征固定化酶的应用1、稳定性差2、回收困难，一次使用3、产物的分离纯化困难一、为什么要对酶进行固定化？二、什么是固定化酶固定化酶（Immobilizedenzyme）：固定在一定载体上，在一定空间范围内起催化作用的酶。水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术必须注意维持酶的催化活性及专一性固定化应该有利于生产自动化、连续化固定化酶应该有最小的空间位阻酶与载体必须结合牢固固定化酶应有最大的稳定性固定化酶成本要低三、固定化酶的制备原则优点固定化酶可以重复，使用效率高，成本低极易将固定化酶与底物、产物分开；在大多数情况下，能提高酶的稳定性；具有一定的机械强度可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；酶反应过程能够加以控制；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；较游离酶更适合多酶反应；可以增加产物的收率，提高产物的质量；酶的使用效率提高，成本降低。四、固定化酶的优缺点缺点•固定化时，酶活力有损失；•工厂初始投资大；•只能用于可溶性底物；•胞内酶必须经过酶的分离。吸附法、包埋法、结合法、交联法五、如何进行酶固定化固定化酶的模式图定义；利用各种固体吸附剂将酶或含酶细胞吸附在其表面上而使酶固定的方法称为物理吸附法，简称吸附法。常用的吸附剂：活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。优点：操作简便、条件温和、不易变性失活、载体廉价、可反复使用。缺点：酶与载体结合不牢固，易脱落。（一）吸附法定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。根据包埋的材料和包埋方法的不同，可分为：凝胶包埋法和半透膜包埋法两类。（二）包埋法将酶分子包埋在凝胶格子里。凝胶包埋法用得最多、最有效，但不适用于底物或产物分子很大的酶类的固定化。1、凝胶包埋法条件温和，操作简便，对酶活影响小，但强度差。天然凝胶：合成凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等；聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等强度高，对温度、pH值变化耐受性强，需要特定的聚合条件，酶易变性。包埋材料将酶包埋在有各种高分子聚合物制成的小囊中，制成固定化酶。半透膜：聚酰胺膜、火棉胶膜等。适用于底物和产物都是小分子的酶的固定化。2、半透膜包埋法（微囊化法）（1）界面沉淀法：利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成皮膜将酶包埋。例：先将含高浓度的酶液在与水互不相溶的有机相中乳化形成油包水的微滴,再将高聚物加入乳化液中,然后使高聚物在油水界面沉淀析出,形成膜,将酶包埋,最后移入水相中。此法条件温和,酶失活少,但是要除去膜上残留有机溶剂很麻烦。制备方法：（2）界面聚合法：利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合原理包埋酶。例：将酶和已二胺的水溶液与葵二酰氯的甲苯溶液混合，再加SPAN乳化已二胺和葵二酰氯，在水相和有机相的界面聚合形成包埋酶的颗粒。1、离子键结合法通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。载体：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素。优点缺点酶与载体结合不牢固，使用时需严格控制好pH值、离子强度、温度等操作条件。（三）结合法条件温和、操作简便、活力损失少。★通过共价键使酶与载体结合的固定化方法。载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。※载体→活化→活化载体基团＋酶分子基团2、共价键结合法适用于含有苯氨基的不溶性载体载体先在稀HCl和亚硝酸钠中进行重氮反应，然后再在温和条件下和酶分子上相应的基团如酚羟基或咪唑基进行偶联。（1）重氮法Tyr含量高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、β-葡萄糖苷酶可与多种重氮化载体连接。（2）叠氮法含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮化合物。活泼的叠氮基团可与酶分子中的-NH2形成肽键，此外叠氮基团还可与酶分子中的-OH、-SH等反应。使酶固定化。如：如：R-O-CH2–COOH+CH3OHR-O-CH2–COOCH3+H2OR-O-CH2–COOCH3+NH2-NH2R-O-CH2–CONH2-NH2+CH3OHR-O-CH2–CONH2-NH2+HNO2R-O-CH2–CON3+H2OR-O-CH2–CON3+E-NH2R-O-CH2–CONH-ER-O-CH2–CON3+E-OHR-O-CH2–CO-O-ER-O-CH2–CON3+E-SHR-O-CH2–CO-S-ECMC(羧甲基纤维素)对于带-OH的载体如葡萄糖、纤维素、琼脂糖来说是最常用的反应。在碱性条件下载体-OH和BrCN反应生成极活泼的亚氨基碳酸酯衍生物，它们在碱性条件下可与酶的氨基进行共价偶联反应。（3）溴化氰法ROHOHCNBr（碱性）ROOHN水ROOHONH2ROONHROONHROHONHNHENZROONENZROHOONHENZ碱性氨基甲酸衍生物亚氨碳酸酯衍生物+ENZ异脲型亚氨碳酸酯型氨基甲酸酯型（4）烷基化法含羟基的载体可用三氯-均三嗪、溴乙酸溴等多卤代物活化。活化载体上的卤素基团可与酶分子上的氨基、巯基、羟基等发生烷基化反应，制备固定化酶。R-OH+NNNClClCle.g.R-ONNNClClR-ONNNNH-EClE-NH2利用双功能试剂，在酶分子间或酶与载体间，或酶与惰性蛋白间进行交联反应，以制备固定化酶的方法。交联试剂：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。（四）交联法双功能试剂：常用的是戊二醛OOH—C—CH2—CH2—CH2—C—H交联反应可以发生在酶分子间也可以发生在酶分子内。在低酶浓度下一般形成分子内交联，交联后的酶通常保持溶解状态。在酶浓度升高情况下分子间交联比例上升。形成的固定化酶通常为不溶解状态。酶50-200mg/ml，戊二醛0.3-0.6%时，固定化酶活性高。一般主张交联剂和酶最适合比例为1：10（W/W）。采用的pH值一般与被交联的酶的等电点相同。酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联•酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶OHC(CH2)3CHO+ENZ(CH2)3NNENZENZNNHCCHNHCNCH交联反应条件激烈，酶的多个基团被交联，致使酶的活力损失大。制备的固定化酶颗粒较小，不便于使用。优点缺点结合牢固，酶不会脱落，可长时间使用。双重固定化（五）热处理法如：将培养好的含葡萄糖异构酶的链霉菌在60~65℃温度下处理15min，可以使葡萄糖异构酶固定在菌体内。将含酶细胞在一定温度下热处理一段时间，使酶固定在菌体内。只适用于热稳定性较好的酶的固定化。四、固定化酶的活力测定方法介绍1.振荡测定法：2.酶柱测定法：评价固定化酶的指标：或称偶联效率，活力保留百分数。相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力方法优点缺点吸附法制作条件温和、简便、成本低、载体再生、可反复使用结合力弱，对pH、离子强度、温度等因素敏感，酶易脱落，酶的装载容量较小共价法载体与偶联方法可选择性大；酶的结合力强，非常稳定偶联条件激烈，易引起酶失活；成本高，某些偶联试剂有一定毒性交联法可用的交联试剂多，技术简易，酶的结合力强，稳定性高交联条件激烈，机械性能差包埋法包埋材料、包埋方法可选余地大，固定化酶的使用面广，包埋条件温和仅可用于低分子量的底物，不适用于柱系统，常有扩散限制问题各种酶固定化方法的比较影响固定化酶（细胞）性质的因素酶经过固定化后引起的性质改变，不外乎两种原因：一是酶本身的变化，二是受固定化载体的物理或化学性质的影响。就载体物化性质和固定化过程影响而言，主要存在以下三种影响效应：.分配效应空间障碍效应扩散限制效应固定化后的特征1、分配效应由于载体和底物的性质差异引起了微环境和宏观环境之间的性质不同。微环境是在固定化酶附近的局部环境，而将主体溶液称为宏观环境。由这种不同造成的底物、产物和各种效应物在两个环境之间的不同分配，被称为分配效应。2、空间障碍效应固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易于底物或效应物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用,所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效应。3、扩散限制效应酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产生了扩散阻力：1）、外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前，发生在固定化颗粒周围的液膜层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。2）、内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化反应同时进行。载体小而弯曲的细孔是产生内扩散阻力的要原因。因此使用低分子量底物，小的粒径、载体孔尽可能大而直且互相连通，或仅仅将酶固定在载体表面都可以降低这种内扩散阻力。1.固定化对酶稳定性的影响(1)固定化酶增加了酶的耐热性(2)固定化增加了酶对变性剂,抑制剂的抵抗能力(3)固定化减轻了蛋白酶的破坏作用(4)固定化可延长酶的操作和保存有效期五、固定化酶的特性可能原因：固定化后酶与载体多点连接，可以防止酶伸展变性；酶活力的缓慢释放；抑制酶的自降解，酶分子之间相互作用的机会大大降低。在工业上半衰期超过一个月有应用价值。固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。但有些固定化酶的最适温度与游离酶比较会有明显的变化。如胰蛋白酶用壳聚糖包埋后最适合温度提高了30℃。用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最适温度比游离酶高5~10℃。2.固定化酶最适温度变化3.固定化酶最适pH变化固定化后酶作用的最适pH值一般会发生变化。影响固定化酶最适pH值的因素主要有两个：载体的带电性质、酶催化反应产物的性质。用带负电荷的载体制备固定化酶，其最适合pH值较游离酶偏高。用带正电荷……一般催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pH值要比游离酶最适pH值的高一些。……固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子质量的大小有一定关系。4.底物特异性作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特异性没有明显变化。如：氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶。可作用于大分子底物，又可作用于低分子底物的酶，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。如：以羧甲基纤维素为载体经叠氮法制备的核糖核酸酶，当以核糖核酸为底物时，催化速度仅为游离酶的2%左右，而以环化鸟苷酸为底物时，催化速度可达游离酶的50%~60%。5.固定化酶的米氏常数(km)的变化固定化酶的表观米氏常数km随载体的带电性能变化。当酶结合于电中性载体时，由于扩散限制造成表观米氏常数km上升。若载体与底物带有相反电荷，固定化酶的表观米氏常数km低于游离酶的km。若载体与底物电荷相同时，就会造成固定化酶的表观米氏常数km显著增加。（一）固定化酶在工业生产中的应用1、固定化氨基酰化酶————第一个工业化的固定化酶DEAE-SephadexA-50乙酰-DL-AlaL-Ala+乙酸+乙酰-D-Ala氨基酰化酶Aminoacylase八、固定化酶的应用泵储罐反应产物离心机消旋反应器固定化酶柱子晶体L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala2、葡萄糖异构酶————生产规模最大的固定化酶3、天冬氨酸酶4、青霉素酰化酶————医药上广泛应用的固定化酶，用于制造各种半合成青霉素和头孢菌素。5、延胡索酸酶6、β-半乳糖苷酶7、天冬氨酸-β-脱羧酶葡萄糖异构酶葡萄糖果糖（二）固定化酶在酶传感器方面的应用酶传感器：固定化酶与能量转换器（电极、场效应管、离子选择场效应管等）密切结合而成的传感装置。酶电极用于样品组分的分析检测，有快速、方便、灵敏、精确等优点。已用于测定各种糖类、抗生素、