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想做LncRNA与蛋白互作？RNAPULLDOWN技术了解一下转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台LncRNA是一类大于200nt的非编码RNA分子，在个体发育和疾病进程中都发挥了重要的作用。近年来，LncRNA的研究重点已经从早期的大规模鉴定，转移到了对具体的某个LncRNA的功能和机制的探索。LncRNA主要通过与其他分子相互作用发挥功能，包括RNA，DNA和蛋白。其中，LncRNA与蛋白的互作是近几年的研究热点，小又今天给大家介绍的就是研究RNA与蛋白互作的方法——RNApulldown。进入正题之前，先通过一篇NatureCommunications的文章“TheLINC01138drivesmalignanciesviaactivatingargininemethyltransferase5inhepatocellularcarcinoma”回顾一下LncRNA在疾病体系中的研究套路：1选中一个LncRNA通过高通量的方法（包括自己测序以及挖别人的数据）筛选到一批LncRNA，然后选一个最特别的（包括变化最明显，表达量最高或最低，以及目前没有相关研究等），在疾病中利用qPCR验证它的表达情况（包括癌与正常样品，癌与癌旁以及初诊和缓解，初诊和复发等），并做临床预后分析（包括与疾病分型，危险度划分，生存时间等的相关性），妥妥凑到figure1a-g！比如我们今天要分析的这篇文章，研究者通过对58对肝癌癌组织和癌旁组织的DNA测序分析，发现有53个LncRNA存在基因拷贝数的改变（CNA），然后结合TCGA中的数据，发现有1082个LncRNA的表达量发生了2倍的变化，两组数据取交集，最终得到4个LncRNA，它们的基因拷贝数增加，并且表达上升，说明这4个LncRNA的高表达是由于基因拷贝数增加引起的。然后选中LINC01138进行下一步分析，因为它的CNA变化最明显。经过qPCR的验证，LINC01138确实在癌组织中高表达，并且与肿瘤大小和生存时间相关。2做表型LncRNA的表达情况只能说明它有可能在疾病中发挥作用，并不是实锤，所以还需要在细胞水平做表型实验的验证，包括在敲低和过表达该长非编码RNA的情况下，检测细胞的增殖（CCK8，EDU，克隆形成等），周期，凋亡，转移和侵袭。一个细胞系的图显得单调并且缺乏说服力（除非该疾病比较特殊，只有一种常用的细胞系），需要多做几个细胞系，这个基本没有上限，但是下限是2个细胞系。做完细胞表型，有条件的话要做动物实验（肿瘤大小的照片，肿瘤体积和重量的统计，小鼠的生存时间曲线等）。只要图够多，凑够2个figure不是问题！在这篇文章中，研究者在两个肝癌的细胞系中，通过敲低和过表达LINC01138做了以下实验。以下图片可能引起不适，请注意！（如何充分利用小鼠展示结果，请参考下图）3搞机制这是研究的难点。想知道LINC01138是通过结合了什么蛋白，发挥了癌基因的作用，就需要用到今天的重点讲解的技术——RNApulldown技术！这个技术听上去很魔幻，其实就是富集某个具体的长非编码RNA，然后分析它所结合的蛋白质。主要实验分为2步：（以下是简化的示意图）1.富集该LncRNA都需要用到磁珠，那么磁珠（beads）如何识别该LncRNA呢？介于目前使用的磁珠大多是链霉亲和素，而链霉亲和素可以有效的识别和结合生物素，所以我们的问题进一步细化成该LncRNA如何被链霉亲和素识别以及如何带上生物素标记。有3种方法：1.1探针法针对该LncRNA的序列，设计生物素标记的探针。目前已经商业化，大家可以咨询相关公司。要注意的是，探针的特异性在很大程度上决定了实验的成功与否，所以一定要找靠谱的公司，有条件的最好用NorthernBlot检测探针的特异性。探针法最大的优势是可以结合内源的LncRNA。缺点是比较贵，需要的样品量（细胞数）大。1.2生物素标记法如果该LncRNA的丰度较低，或者样品有限，可以考虑体外合成该LncRNA。在LncRNA的5‘端加上T7启动子，利用体外转录试剂盒，可以制备大量的LncRNA。再通过生物素标记试剂盒，就能得到大量的生物素标记的LncRNA。常用的折叠的方法退火，从95℃退火到4℃，大约30秒一度就可以了。1.3TRSA法除了生物素，链霉亲和素还可以识别TRSA结构，因此在LncRNA的一端加上TRSA序列也是不错的选择，还省去了购买生物素标记试剂盒的钱。TRSA是一段人工合成的不到200bp的片段，具体序列大家可以参考这篇文章。2.蛋白分析将得到的LncRNA与细胞裂解液孵育一定时间，使长非结合相应的蛋白，再用链霉亲和素磁珠结合带标记的LncRNA，就能得到与RNA结合的蛋白。通过蛋白质谱的检测，就能知道具体的蛋白。回到NatureCommunications的这篇文章，研究者利用RNApulldowm技术，发现LINC01138与PRMT5结合，这就像种了彩票一样，因为PRMT5是已知的癌基因，所以LINC01138通过调控PRMT5发挥癌基因的作用，就顺理成章了。LINC01138的siRNA和PRMT5的抑制剂联合使用，取得更好的抗癌效果。关于LncRNA与蛋白结合后影响了蛋白的哪些功能，又是如何影响的，就是我们下一次分享的主题了。想到了一些大家可能关注的问题，以下是自问自答环节：1.问：体内的LncRNA具有特殊的二级结构，并且对它的功能也至关重要，那么，体外转录的LncRNA，如何保证其二级结构的正确性呢？答：这个问题很复杂，LncRNA的二级结构受一级结构（碱基序列）以及结合的蛋白影响，体外合成的LncRNA可以通过退火的方式进行折叠，结构主要由一级结构决定，这是目前最常用的方法。常用退火方法是从95℃退火到4℃，大约30秒一度就可以了。2.问：RNApulldown实验有对照吗？答：有，探针法和生物素标记法的对照都是相应的反义序列：探针的反义序列以及长非编码RNA的反义序列。TRSA法的对照是TRSA序列本身。3.问：蛋白质谱得到了很多蛋白，该怎么选？答：当然选在你研究体系中特别牛的蛋白啊！！！选个功能未知的蛋白还要费力气去研究这个蛋白的功能，嗯，也不是不可以，做人最重要是开心。