CRISPR-Cas9-的原理及其在疾病治疗-中的研究进展

《发育医学电子杂志》2017年1月第5卷第1期JDevelopmentMed，Jan2017，Vol.5，No.1·35·CRISPR/Cas9的原理及其在疾病治疗中的研究进展王亮　赵同标（中国科学院动物研究所　干细胞与生殖生物学国家重点实验室，北京　100101）·综述·规律成簇间隔短回文重复序列（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR）及其相关Cas9蛋白介导的新一代基因编辑技术具有操作容易、成本低廉的优势，可实现精确高效的基因编辑功能，包括定点插入、定点敲除及定点突变等，已广泛用于多种动植物的基因编辑。近年来，CRISPR技术迅速发展，应用范围已拓展到基因调控、表观修饰、基因成像等领域。其在疾病治疗方面更是显示出广阔的应用前景。本文首先介绍CRISPR的作用机制、工作模型，进而就其研究历史及最新进展进行阐述，并对其在疾病治疗方面的应用进行归纳举例。1　CRISPR/Cas系统概述随着DNA双螺旋结构的解析及中心法则的确立，分子生物学技术获得迅猛发展，DNA重组技术的出现更是开启了生命科学的新纪元，为实现基因组定点编辑提供了理论基础与技术保障。长期以来，科学家一直致力于如何精准、高效地对基因组进行操作，以实现对基因功能的解析及遗传性状的修饰。由此，相继发展出了ZFN（zincfingernucleases）、TALEN（transcriptionactivator-likeeffectornucleases）及CRISPR等基因编辑技术。这3种基因编辑技术都基于同一原理，即通过特定的DNA结合结构域识别并结合到特异性的目标DNA序列上，引导序列特异性的内切酶在目标序列附近进行切割，造成DNA双链断裂（double-strandedbreak，DSB），进而激活体内的DNA修复系统，包括非同源末端连接（non-homologousendjoining，NHEJ）和/或同源重组修复（homology-directedrepair，HDR）。通过这两种修复途径，可以实现对基因组改造的目的，即基因敲除、引入特异突变和基因插入等。ZFN和TALEN都是以蛋白质介导的，通过特异的结合蛋白与DNA目标位点结合，在非特异性的核酸酶FokⅠ的作用下进行切割［1-2］；而CRISPR/Cas9则是以RNA介导的，以碱基互补配对结合目标DNA序列，这样针对每个位点只需简单变换引导RNA序列即可，不必像前者一样每次合成和组装不同的DNA识别蛋白；此外，CRISPR还可同时编辑1个细胞中的多个位点［3］，位点选择也更加多样和灵活。因此，CRISPR操作容易，成本低，而且准确、高效，很快便得到了广泛应用。２　CRISPR/Cas系统的结构、作用机制及工作模型2.1　CRISPR/Cas系统的结构及作用机制　CRISPR/Cas系统由CRISPR基因簇和Cas蛋白共同组成，是细菌和古细菌抵抗噬菌体侵染的一种适应性免疫机制［4］。CRISPR基因簇由多个重复序列（repeat）及与外源基因元件一致的非重复间隔序列（spacer）组成R-S结构。噬菌体初次侵染宿主细胞时，CRISPR系统可通过R-S结构识别入侵核酸，并基金项目：科技部973计划（2013CB966901）；国家自然科学青年基金（31400831）；国家自然科学面上基金（31570995）通讯作者：赵同标（Email：[e-mail]）·36·《发育医学电子杂志》2017年1月第5卷第1期JDevelopmentMed，Jan2017，Vol.5，No.1通过扫描外源DNA序列上潜在的PAM（protospaceradjacentmotif）获取邻近的一小段DNA序列，将其加工后重组到两个重复序列之间形成新的非重复间隔序列，获得针对该噬菌体的免疫能力［5］；当噬菌体再次侵袭时，CRISPR系统即可根据新获得的非重复间隔序列转录加工出引导RNA（guideRNA，gRNA），引导Cas蛋白识别并切割目标DNA［6］，从而达到免疫防御的效果。CRISPR/Cas系统可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，其中在产脓链球菌中发现的Ⅱ型系统由于只需1个Cas蛋白（即Cas9）即可发挥核酸内切酶活性，相对比较简单且操作容易，因而研究最为广泛，被改造成为现今高效的基因编辑工具CRISPR/Cas9。改造后的CRISPR/Cas9将原本独立的crRNA（CRISPRRNA）及tracrRNA（trans-actingCRISPRRNA）融合为一条单链引导RNA（single-strandedguideRNA，sgRNA）［4］。CRISPR基因座首先转录出前体crRNA及tracrRNA，两者通过碱基互补配对形成异二聚体，然后在Cas9的帮助下，前体crRNA被核酸内切酶RNaseⅢ剪切为成熟crRNA［7］。成熟crRNA含有可与目标DNA互补配对的非重复间隔序列，即人工设计的20nt的gRNA，可引导Cas9蛋白实现对目标DNA序列的切割，使得CRISPR/Cas9系统更加简化，并被广泛应用于基因编辑领域。Cas9蛋白含有多种同源物，包括SpCas9、SaCas9及AnaCas9等，其中广泛应用于基因编辑领域的是SpCas9。SpCas9由α螺旋状的识别瓣叶（recognitionlobe，REC）和核酸酶瓣叶（nucleaselobe，NUC）组成。REC可识别并结合sgRNA和目标DNA的复合体。NUC包含HNH核酸酶结构域、RuvC-样核酸酶结构域、PAM相互作用区（PAM-interactingdomain，PI）及楔形域（wedgedomain，WED）。HNH与RuvC可分别切割目标DNA上与crRNA互补及非互补的DNA链。PI负责与目标DNA的PAM区相互作用，促进Cas9蛋白切割的特异性。对于SpCas9蛋白而言，PAM为目标DNA的5’-NGG-3’序列，它的PI结构域的两个精氨酸残基（Arg1333和Arg1335）可以通过氢键与非目标链PAM的GG二核苷酸结合［8］，从而区别于其他类型的Cas9蛋白（如SaCas9识别的是5’-NNGRRT-3’PAM）。此外，SpCas9也可识别5’-NAG-3’序列，但切割效率明显降低。WED则可与REC共同识别crRNA-tracrRNA二聚体的互补配对区及目标DNA的PAM区［9］。CRISPR/Cas9系统的组成结构及功能见表1。Cas9蛋白对目标DNA序列的切割见图1。表1CRISPR/Cas9系统的组成结构及功能组分及结构单元功能sgRNAcrRNA识别目标DNA约20bp的片段并互补配对，引导Cas蛋白进行切割tracrRNA与crRNA形成异二聚体Cas9蛋白REC识别并结合sgRNA和目标DNA的复合体NUC核酸酶HNH切割与crRNA互补的目标DNA链核酸酶RuvC切割非目标DNA链PI与目标DNA的PAM区相互作用WED识别sgRNA以及目标DNA的PAM注：sgRNA：单链引导RNA（single-strandedguideRNA）；crRNA：CRISPRRNA；tracrRNA：trans-actingCRISPRRNA；REC：识别瓣叶（recognitionlobe）；NUC：核酸酶瓣叶（nucleaselobe）；PAM：protospaceradjacentmotif；PI：PAM相互作用区（PAM-interactingdomain）；WED：楔形域（wedgedomain）注：REC：识别瓣叶（recognitionlobe）；tracrRNA：trans-actingCRISPRRNA；sgRNA：单链引导RNA（single-strandedguideRNA）；NUC：核酸酶瓣叶（nucleaselobe）；PAM：protospaceradjacentmotif；crRNA：CRISPRRNA图１Cas9蛋白切割目标DNA示意图《发育医学电子杂志》2017年1月第5卷第1期JDevelopmentMed，Jan2017，Vol.5，No.1·37·2.2　CRISPR/Cas9切割目标DNA的工作模型［10］及修复机制　在这个模型中，Cas9蛋白在未激活时处于自身抑制的状态，其HNH由于与RuvC结合而无法显示切割活性［11］。只有当sgRNA结合上之后才能使其构象发生改变，在两个瓣叶之间形成可容纳DNA的通道［9］，从而使得Cas9蛋白展示出DNA识别结构［12］。随后，Cas9-sgRNA复合体通过PI结构域结合到目标DNA的PAM基序上，启始PAM附近的DNA双链打开，促进sgRNA-DNA异源二聚体形成［8］。只有当sgRNA-DNA碱基对显著匹配后，DNA双链才能完全打开，形成sgRNA-DNA异源二聚体。这里应当注意，异源二聚体的形成并不要求与gRNA的20个碱基全部配对，成熟crRNA末端含有一段称为“种子区”的序列，其对目标DNA的严格匹配仅限于紧随PAM的7个核苷酸［13］；而PAM远端的区域可以容许少数错配。有研究表明，10nt以上的gRNA结合即可启动HNH构象改变［12］，虽然效率低于全部匹配的情况［14］。最终，Cas9-sgRNA-DNA三元复合物的形成使HNH构象发生改变，HNH和RuvC通过核酸内切酶活性切割目标DNA链：HNH切割与crRNA互补配对的模板链，切割位点位于PAM的5’端的第3个碱基外侧；RuvC对另一条链进行切割，切割位点位于PAM上游的3～8碱基之间［15］。结果造成DSB，机体随之启动修复机制。修复机制包括NHEJ及HDR两种类型，见图2。NHEJ是一种易错修复，能够在DSB位点造成随机插入或删除，当发生移码突变或重要结构破坏时可实现基因敲除［16］；HDR则可通过导入donorDNA的方法，以同源重组的方式在DSB处生成所需的序列替换，实现基因定点删除、插入、突变或基因矫正［17］。然而，在细胞内，NHEJ发生频率远高于HDR。为提高同源重组介导的精确修复就需要提高HDR发生的频率。Lin等［18］发现在同步化的M期细胞导入Cas9-sgRNA复合体可以将HDR的比率从9%提高到33%；Yu等［19］通过大规模小分子筛选发现L755507和brefeldinA能提高HDR比率。此外，通过添加抑制剂Scr7［20］阻断NHEJ途图2CRISPR/Cas9介导的非同源末端连接（NHEJ）与同源重组修复（HDR）径中关键的DNA连接酶Ⅳ或敲降编码该酶的基因［21］，也能间接达到提高HDR比率的目的。3　CRISPR/Cas9的研究历程与最新进展3.1　CRISPR/Cas9研究历程中的重要事件　从1987年首次发现CRISPR重复序列，到如今CRISPR/Cas9技术获得广泛应用，仅仅经历了短短的30年时间，其间包含了一个又一个里程碑式的发现，促成了CRISPR技术的广泛应用。其中，DoudnaJ、CharpentierE和华人科学家张锋率先将CRISPR从细菌免疫防御系统开发为实用的基因编辑工具［3-4］，奠定了CRISPR技术在基因编辑领域的重要地位。研究历程的重要事件见表2。3.2　CRISPR/Cas9研究的最新进展　CRISPR/Cas9技术的问世，极大地推动了生物学研究进程。其不仅在基因编辑领域展现出无与伦比的优势与应用价值，同时也可通过改造应用于基因调控、表观修饰、基因成像等方面。接下来对近年来这些方面取得的进展进行汇总。3.2.1　CRISPR/Cas9与基因编辑　近来发现CRISPRⅡ型系统的另一核酸内切酶Cpf1蛋白能够不依赖于tracrRNA，只通过crRNA对目标DNA进行切割，且其切割效率及特异性均类似于Cas9蛋白［33-35］。同样来源于CRISPRⅡ型系统的C2c2蛋白则包含两个高等真核生物和原核生物与RNA酶相关的核苷酸结合域，可以靶向RNA切割，删除特定序列，降低相应蛋白的表达水平［36-37］。这些发·38·《发育医学