食品中维生素的测定

1一、概述二、脂溶性维生素的测定三、水溶性维生素的测定第十一章食品中维生素的测定2一、概述维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类微量有机化合物。其种类很多，目前已确认的有30余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种。这些维生素结构复杂，理化性质及生理功能各异，有的属于醇类，有的属于胺类，有的属于酯类，还有的属于酚或醌类化台物31.维生素具有的共同特点（1）这些化合物或其前体化合物都在天然食物中存在；（2）不能供给机体热能,也不是构成组织的基本原料；（3）主要作为辅酶的成分调节代谢过程，需要量极小；（4）一般在体内不能合成，或合成量不能满足需要，必须经常从食物中摄取；（5）缺乏会导致相应的疾病。42.维生素的分类脂溶性维生素包括维生素A、D、E、K水溶性维生素包括B族维生素（维生素B1、B2、PP、B6、叶酸、B12、泛酸、生物素）和维生素C。53.测定意义（1）食品科学研究者需要准确的食品成分分析信息，计算营养素的膳食摄入，以改善人类的营养；（2）食品营养价值评价（3）食品生产工艺设计及强化食品的评价（4）食品资源开发（5）食品标签的准确性64.测定方法（1）涉及人体和动物的生物分析方法；（2）利用原生生物、细菌和酵母等的微生物分析方法；（3）化学法、分光光度法、荧光法、色谱、酶法、免疫和放射等物理化学分析方法。7化8脂溶性维生素的理化性质溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚等有机溶剂。耐酸碱性：VA、VD对酸不稳定，对碱稳定；VE对酸稳定，对碱不稳定。耐热性：VA、VD、VE耐热性好，能经受煮沸耐氧化性：VA易被氧化，光、热促进氧化VE易被氧化，光、热、碱促进氧化VD性质稳定，不易氧化二、脂溶性维生素的测定9在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。对于A、D、E、K共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。测定脂溶性维生素的流程皂化样品水洗去除脂类物有机溶剂提取脂溶性维生素(不皂化物)浓缩溶于适当的溶剂→→→→→测定→10维生素A存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼肝油、蛋类、乳类等动物性食品中。植物性食品中不含VA，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为VA，故称为VA原。（一）维生素A的测定1112（1）三氯化锑比色法（2）紫外分光光度法（3）荧光法（4）气相色谱法（5）高效液相色谱法。维生素A的测定方法131.三氯化锑比色法维生素A在氯仿溶液中与三氯化锑相互作用，生成蓝色可溶性物质，在620nm波长处有最大吸收峰，其颜色深浅与维生素A的含量在一定的浓度范围内成正比，故可比色测定。原理14适用于维生素A含量较高的样品（高于5-10μg/g），对低含量样品，因受其他脂溶性物质的干扰，不易比色测定该法的主要缺点：是生成的蓝色物质的稳定性差。比色测定必须在6秒钟内完成，否则蓝色会迅速消退，将造成极大误差。适用范围及特点15注意：（1）维生素A见光易分解，整个实验应在暗处进行，防止阳光照射，或采用棕色玻璃仪器避光。（2）三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯化锑遇水生成白色沉淀。因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。16仪器回流冷凝装置分光光度计17（1）无水硫酸钠试剂（2）乙酸酐（3）乙醚：不含有过氧化物（4）无水乙醇（5）氯仿(三氯甲烷）18（6）250g/L三氯化锑—氯仿溶液（7）50％氢氧化钾溶液（8）0.5mol/L氢氧化钾溶液（9）1mg/mL维生素A或视黄醇乙酸酯标准溶液（10）酚酞指示剂19准确吸取维生素A标准液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL容量瓶中，用氯仿定容至刻度。分别吸取上述各标准系列溶液lmL于比色皿中，各加乙酸酐1滴，摇匀，于620nm处，以氯仿调节吸光度零点，将其标准比色液按顺序移入光路前，迅速加入9mL三氯化锑—氯仿溶液。于6s内测定吸光度，以维生素A含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。操作步骤（1）标准曲线的绘制20①皂化（2）样品处理根据样品性质，处理方法可采用皂化法或研磨法。皂化法：适用于维生素A含量不高的样品，可减少脂溶性物质的干扰，但全部实验过程费时，且易导致维生素A损失。②提取③洗涤④浓缩21水层皂化瓶内混合物分液漏斗1号水洗乙醚洗振摇，静置，分层水层醚层分液漏斗2号振摇，静置，分层醚层水层分液漏斗3号振摇，静置，分层醚层分液漏斗1号提取22振摇，静置，分层分液漏斗1号水洗醚层水层KOH溶液洗振摇，静置，分层醚层KOH溶液层水洗振摇，静置，分层醚层水层振摇，静置，分层水洗醚层水层洗涤23分液漏斗醚层乙醚洗涤水浴蒸馏减压抽干氯仿定容（25mL)无水硫酸钠浓缩24（3）测定取2支比色皿，分别加入1mL氯仿和lmL样品溶液，各加入1滴乙酸酐，于620nm波长处以氯仿调节吸光度零点，将其移入光路前，迅速加入9mL三氯化锑—氯仿溶液。于6s内测定吸光度。25结果计算C----由标准曲线上查得样品溶液中维生素A的含量（µg）m-----样品质量（g）V1----样品提取液的总体积（mL）V2----测定用样品提取液的体积（mL）100100021VmVcxX---VA含量（mg/100g)26①研磨研磨法：适用于每克样品维生素A含量大于5～10µg样品的测定，如动物肝脏的检测。步骤简单，省时，结果准确。②提取③浓缩（3）测定同皂化法27结果计算式中：C----由标准曲线上查得样品溶液中维生素A的含量（µg）m-----样品质量（g）V1----样品提取液的总体积（mL）V2----测定用样品提取液的体积（mL）10021VmVcx28（1）本法为国家标准方法，适用于食品中维生素A的测定。（2）乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象。在提取洗涤操作中，不要用力过猛，若发生乳化，可加几滴乙醇。（3）所用氯仿中不应含有水分，因三氯化锑遇水会出现沉淀，干扰比色测定。故在每lmL氯仿中应加入乙酸酐l滴，以保证脱水。说明与注意事项29（4）由于三氯化锑与维生素A所产生的蓝色物质很不稳定，通常6s以后便开始褪色，因此要求反应在比色皿中进行，产生蓝色后应立即读取吸光值。（5）如果样品中含有β--胡萝卜素(如奶粉、禽蛋等食品)干扰测定，可将浓缩蒸干的样品用正己烷溶解，以氧化铝为吸附剂，丙酮—己烷混合液为洗脱剂进行柱层析。（6）三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯化锑遇水生成白色沉淀，因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。30（二）胡萝卜素的测定胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，有多种异构体和衍生物，总称为类胡萝卜素，其中在分子结构中含有β-紫罗宁残基的类胡萝卜素，在人体内可转变为维生素A，故称为维生素A原。如α、β、γ胡萝卜素，其中以β-胡萝卜素效价最高。31胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。可用有机溶剂提取,在450nm波长处有最大吸收，故只要能完全分离，便可定性和定量。但在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在提取β-胡萝卜素时，这些色素也能被有机溶剂提取，因此在测定前，必须将胡萝卜素与其它色素分开。常用的方法有纸层析、柱层析和薄层层析法。32纸层析法是以滤纸及其结合水形成的复合物作为固定相，将待分离的样品溶液点在滤纸的一端，在密闭的容器中，用适宜的溶剂（展开剂）作为流动相，带动样品斑点，从滤纸的一端向另一端迁移，此称为展开。由于样品中各组分与滤纸亲和力的强弱差异，及在展开剂中溶解度的大小不同，在展开过程中，经过反复的吸附、解吸，经一定时间产生差速迁移，使样品中各组分得以分离。经显色剂显色，可在滤纸上看到分离的斑点，这些斑点就是通常所说的色谱。33在两相中，吸附力弱，溶解度大的组分，迁移速度快，斑点距原点的距离就大；反之则相反。纸层析是一种简单、迅速、有效的分离、鉴定或定量有机物质的方法。在食品检验中，多用于糖类、氨基酸、维生素等成分的分析，以及食品中有害物质如黄曲霉毒素、有机氯农药和有机磷农药残留量的分析。34原理以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离，剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450nm波长下定量测定。35仪器玻璃层析缸皂化回流装置分光光度计旋转蒸发器恒温水浴锅点样器或微量注射器36试剂（1）石油醚(沸程30~60℃)（2）丙酮（3）丙酮—石油醚（3：7）混合液（4）无水硫酸钠（5）50g/L硫酸钠溶液（6）50％氢氧化钾溶液（7）无水乙醇（8）500µg/mLβ-胡萝卜素标准溶液37标定：取标准溶液10µl，加正己烷3.0mL，混匀，在波长450nm测定吸光值，以正己烷为空白，平行测定三份，取平均值。式中：A------标准溶液的吸光度ρ------胡萝卜素标准溶液浓度（mg／mL）E-----β—胡萝卜素在正己烷溶液中，波长450nm,比色皿厚度为lcm，溶液浓度为1mg/L的吸光系数，其值为0.26383.01/0.01----稀释倍数1/1000-----将mg/L换算成mg/mL01.0100001.3EAp38②蔬菜与其他植物性食物：取可食部分用水洗净后，用纱布吸去水滴，切碎，用组织捣碎机制成匀浆，贮于塑料瓶内于冰箱中保存备用。（1）样品的采集和制备①粮食：样品用水洗净，置60℃烘箱中烘干，磨碎，贮于塑料瓶内，盖紧瓶塞保存，备用。测定步骤39以下步骤需在避光条件下进行。（2）样品处理：①粮食、蔬菜样品：取匀浆1.0000～5.0000g，粮食样品视含量而定，置100mL具塞三角瓶中，加入丙酮20mL，石油醚5mL，振摇lmin，静置5min，将提取液转入盛有100mL50g/L硫酸钠溶液的分液漏斗中，再于三角瓶中加入10mL丙酮+石油醚混合液，振摇lmin，放置5min，将提取液并入分液漏斗中，如此提取2～3次，直至提取物呈无色为止。40②植物油和高脂肪样品：需先皂化，取适量样品(小于10g)，加入脱醛乙醇30mL，1:1氢氧化钾溶液10mL，加热回流30min，然后用冰水使之迅速冷却，皂化后样品用石油醚提取，直至提取液呈无色为止。（3）洗涤（4）浓缩与定容（5）纸层析41①点样：在18×30cm滤纸下端距底边4cm处做一基线，在基线上取A、B、C、D4点，吸取0.1~0.4mL浓缩液在AB和CD间迅速点样。42②展开：待纸上所点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，放于预先用石油醚饱和的层析缸中，进行展开。③洗脱：待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤纸，挥发干石油醚，将位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带剪下，立即放入盛有5mL石油醚的具塞试管中，用力振摇，使胡萝卜素完全溶于溶剂中。（6）比色测定以石油醚调节零点，于450nm波长下比色，测吸光度，以其值从标准曲线上查出β-胡萝卜素的含量。43（7）标准曲线绘制取浓度为50μg/mLβ-胡萝卜素标准液0、1、2、3、4、6、8mL，分别置于100mL具塞三角瓶中，按样品测定步骤进行操作，点样体积为0.1mL，标准曲线各点胡萝卜素含量依次为0.0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0μg。在测定低含量样品时，可在0～2.5μg间加做几点，以胡萝卜素含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。44结果计算式中：ｘ--胡萝卜素的含量（mg/100g）C----在标准曲线上所查得的胡萝卜素的含量（µg）V1----点样体积（mL）V2----样品石油醚提取液浓缩后的定容体积（mL）m-----样品质量（g）100100012VmVcx451.本法为国家标准方法，适用于植物性食物和含有植物性食物的混合食物中胡萝卜素的测定，其最小检出量为0.11µg。2.浓缩提取液时，一定要防止蒸干，避免胡萝卜素在空气中氧化或因高温、紫外线直射等破坏。3.定容、点样、层析后剪样点等操作环节一定要迅速。说明与注意事项46（三）维生素D的测定维生素D是指含有抗佝偻病活性的一类物质，具有维生素