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临床免疫定性检测性能评估浙江省临床检验中心卫生部临床检验中心康凤凤王治国EP12-AUserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline.CNAS-CL09医学实验室质量和能力认可准则在临床免疫学定性检验领域的应用说明王治国主编.《临床检验方法确认与性能验证》参考文献2临床免疫学检测定量试验半定量试验：结果报告为阴性、1+、2+、3+、4+或滴度的方法，例如抗核抗体（ANA）滴度的报告等定性试验（qualitativetests）：只有两种检测结果（例如：阳性/阴性、存在/不存在、有反应的/无反应的）的方法。3根据临床用途可分为：筛查试验（screeningtests）：用于检测人群中分析物的存在情况，如性病研究实验室（VDRL）梅毒血清学试验。一般而言，应当具有较高的诊断灵敏度（临床检出率大于95%）。诊断试验（diagnostictests）：用于检测临床上已怀疑某种分析物（例如感染性病原体抗原或相关抗体）的存在情况。确诊试验（confirmatorytests）：用于验证筛查试验或者诊断试验的结果，可以是免疫学测定（WB、RIBA或抗体中和试验），也可以是培养或核酸检测。特异性和阳性预测值比敏感性和阴性预测值更重要，特异性应大于98~99%。临床免疫学检测401实验室技术人员的培训和评估02制订质量保证计划03标本采集与处理试剂和仪器设备的熟悉标本的处理和保存试剂的处理和保存合理的检测程序合理的结果解释系统的质量控制为保证性能验证检测过程中结果的一致性，必须采用合适的质控品（至少使用一个阳性/阴性质控品，可参考临界点附近的检测信息）评估前准备5严格按照SOP采集标本标本采集时间、容器、运送条件内部外部干扰因素分析特异性对转化血清盘的检测能力分析灵敏度正确度精密度指标定性检测重要性能指标6干扰因素分析特异性对转化血清盘的检测能力分析灵敏度正确度精密度指标7定性检测重要性能指标指标——精密度精密度precision在规定条件下，对同一或类似被测对象重复测量所得示值或测得值间的一致程度。不能给出被测量的数值，在指定目的下只能以“足够”或“不足”进行描述。其程度通常用不精密度（imprecision）表示，如标准差、方差或变异系数表示，是对随机误差的衡量8不精密度的来源：指标——精密度标本状态及处理；标本、试剂的运输和贮存条件；操作人员；环境条件；仪器或检测系统；检测程序（加样、温育、洗涤、结果判读时间等）9临界值cut-offvalue鉴别样品，作为判断特定疾病、状态或被测量存在或不存在的界限的数值或量值。测量结果高于临界值判断为阳性而低于临界值判断为阴性。测量结果接近临界值判断为非确定性临界值的选择决定检验的诊断特异性和诊断灵敏度。术语和定义——ISO18113-1C5C50C95检测浓度为C5的分析物时将产生5%的阳性结果。用浓度C5的样本进行重复性检测时，将持续得到阴性结果处于或接近临界值的分析物浓度，多次重复检测此浓度的单一样本时将获得50%的阳性结果和50%的阴性结果。厂家根据检测目的及敏感性和特异性建立的临界值浓度检测浓度为C95的分析物时将产生95%的阳性结果。用浓度C95的样本进行重复性检测时，将持续得到阳性结果术语和定义11C5-C95区间（“灰区”）：临界值附近的分析物浓度范围，在该范围外的检测结果持续阳性（浓度C95）或持续阴性（浓度C5）。C5-C95区间反映了重复检测可能获得不完全一致结果的浓度范围，其宽度可表示定性检测的不精密度。12术语和定义不精密度曲线13两种不同方法的不精密度曲线比较14阴阳性质控品准备样本重复性试验精密度要求：C5-C95区间≤C50±20%评估方案要素：若±20%范围包含了C5-C95区间，那么距离C50的20%或更远浓度的标本将得到一致的检测结果。实验室可根据检验项目预期临床用途设置特定的可接受精密度要求。-20%+20%151.确定临界值浓度2.准备标本三个浓度水平，分别为C50，C50-20%，C50+20%。每个水平需保证≥40次重复检测的需要3.每个浓度水平重复检测40次，计算阴阳性率4.结果判断：1）C50是否准确？2）C50±20%浓度范围是否包含C5-C95区间？试验步骤：16检测试剂或系统说明书可能会注明分析物的临界浓度。如果厂家未提供，则可以将阳性标本进行一系列倍比稀释进行重复检测，以确定能够获得50%阳性和50%阴性结果的那个稀释度，即为临界点（C50）。17如何获得C50？结果判定：1）C50是否准确？18根据检测次数和阳性结果次数的双侧95%计分可信区间，提示阳性结果的真正百分比重复性检测数阳性结果样本的实际浓度次数百分比真正百分比201050%30%～70%C30～C70402050%35%～65%C35～C651005050%40%～60%C40～C60结果判定：1）C50是否准确？检测数阳性结果数阳性百分比C50准确性判定40≤13次≤32.5%不正确（5%Ⅰ类错误）≥27次≥67.5%4014～26次35%～65%正确注：C50可信度取决于实际实验结果和检测数192）C50±20%浓度范围是否包含了C5~C95区间？20如果在+20%浓度阳性率≤87.5%（35/40），则在该浓度下真正的阳性率单侧95%计分可信区间上限≤94%所以如上表结果：+20%浓度下重复检测真实的阳性率≥95%(C95)-20%浓度下重复检测真实的阴性率≥95%(C5)212）C50±20%浓度范围是否包含了C5~C95区间？222）C50±20%浓度范围是否包含了C5~C95区间？232）C50±20%浓度范围是否包含了C5~C95区间？举例——尿液hCG定性检测1.临界值浓度：C50为16mIU/mL2.准备标本：16mIU/mL，19mIU/mL，13mIU/mL3.结果判定：1）重复检测40次，阳性率40/40，C50±20%浓度范围包含C5-C95区间的置信度为86%2）重复检测60次，阳性率60/60，C50±20%浓度范围包含C5-C95区间的置信度为92.6%C50准确与否及C50±20%浓度范围是否包含了C5~C95区间的判定与检测结果、重复检测数相关通过与临床诊断、金标准方法和经过验证确认血清样本盘的检测比较来评价，常以灵敏度（诊断敏感性）/特异性（诊断特异性）或阳性符合率/阴性符合率来表示。指标——正确度26标本：至少50/50阴阳性标本，最好为患者标本，尽可能新鲜（血迹等除外）、量足时间：两个方法同时检测一个标本，为期10-20天数据记录与核查：分析质控结果，剔除异常结果，分析原因，重新检测补齐检测数。数据分析：1）与金标准比较2）与其他比较方法（非金标准）评估方案2728灵敏度sensitivity又称真阳性率，在明确有特定临床疾病的患者中，诊断试验检测为阳性或超过决定限例数的比例，反映新试验正确判断是否罹患某种疾病的能力。计算公式为：A/(A+C)×100%，理想的测定方法临床诊断敏感性应为100%特异性specificity又称真阴性率，在明确无特定临床疾病的患者中，诊断性试验结果为阴性或在决定限范围内的比例，反映新试验正确排除某种疾病的能力。计算公式为：D/(B+D)×100%，理想的测定方法临床诊断特异性应为100%。阳性预测值positivepredictivevalue检测为阳性的标本实际上为阳性的可能性。计算公式为：A/(A+B)×100%，理想的测定方法阳性预测值应为100%，即无假阳性。阴性预测值negativepredictivevalue检测为阴性的标本实际上为阴性的可能性。计算公式为：D/(C+D)×100%，理想的测定方法阴性预测值应为100%，即无假阴性。正确度：1）与金标准比较真阳性真阴性假阴性假阳性根据上述公式计算得到的检测性能指标仅是对真实性能的点估计值，因为其仅针对研究群体的某一部分个体。如果检测其他个体，或在不同时间段对同一部分标本进行检测，那么检测性能的估计值可能在数值上存在差异利用可信区间和显著性水平量化样本/个体选择造成的统计不确定性，这种不确定性会随着研究样本数的增加而减小But……29配对二分类资料率及率差可信区间①Wilson计分可信区间（Wilsonscoreinternal)②AC可信区间（Agresti-Coullinternal）③Jeffreys可信区间（Jeffreysinternal）④……301）灵敏度的95%计分可信区间2）特异性的95%计分可信区间31如果定性试验的的灵敏度和特异性能够被用户接受，就无必要再做其他数据分析。若想明确两种检测方法在检测性能上是否有差异，需联合比较灵敏度和特异性。通常采用试验方法、比较方法和临床诊断三组两两比较的方式报告。32灵敏度比较33灵敏度差异95%可信区间：34特异性差值：特异性比较35特异性差异95%可信区间：36案例概要两种商品化的酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒用检测153例梅毒螺旋体感染状况已确定的患者血清案例分析（与金标准比较）37参数计算：灵敏度=100%[A/(A+C)]=100%[86/92]=93.5%特异性=100%[D/(B+D)]=100%[59/62]=95.2%阳性预测值=100%[A/(A+B)]=100%[86/89]=96.6%阴性预测值=100%[D/(C+D)]=100%[59/65]=90.8%案例分析（与金标准比较）38灵敏度95％计分可信区间为[86.5%,97.0%]灵敏度95%可信区间案例分析（与金标准比较）39特异性95％计分可信区间为[85.7%,99.3%]特异性95%可信区间案例分析（与金标准比较）40案例分析（与金标准比较）41灵敏度88.0%，95％计分可信区间为[80.7%,94.2%]特异性82.3%，95％计分可信区间为[71.0%,89.8%]评价方法的灵敏度93.5%高于比较方法的灵敏度88.0%评价方法的特异性95.2%高于比较方法的特异性82.3%案例分析（与金标准比较）42灵敏度差值特异性差值案例分析（与金标准比较）4395％计分可信区间[-1.79，11.54]95％计分可信区间[4.34，17.76]灵敏度差值可信区间包括“0”，差异无统计学意义,特异性差值可信区间不包括“0”，差异有统计学意义，新检测方法的特异性优于比较方法44若无可用的诊断标准，需将待评价试剂与某一已验证方法进行比较，此时得到的并非方法的正确度，而是两种方法的符合程度因此不能计算灵敏度和特异性，而应计算阳性符合率和阴性符合率正确度：2）无诊断标准时的比较45总符合率=100%×[(a+d)/n]阳性符合率（PPA）=100%×[a/(a+c)]阴性符合率（NPA）=100%×[d/(b+d)]4647＋－48案例分析（无诊断标准时）案例概要两种丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）检测方法，待评价方法为ELISA法，比较方法为免疫印迹，共检测1072份标本49参数计算：50试剂A已验证方法共计+-+80282-3810241062共计11810261144符合率的意义试剂B已验证方法共计+-+8038118-210241026共计8210621144总符合率=(80+1024)/1144×100%=96.5%阳性符合率=80/82×100%=97.6%阴性符合率=1024/1062×100%=96.4%总符合率=(80+1024)/1144×100%=96.5%阳性符合率=80/118×100%=67.8%阴性符合率=1024/1026×100%=99.8%两组试剂与已验证方法的总符合率相同，但是两种试剂的性能可以有很大差别，试剂A的阳性符合率远低于试剂B的阳性符合率。51待评价试剂（方法）与已验证方法相比较，得出的阳性符合率和阴性符合