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海洋生物学实验讲义（环境科学与工程学院海洋科学专业）巩宁2010.102目录实验一海洋生物的显微镜观察·····························································3实验二海洋浮游植物形态观察···························································9实验三海洋浮游动物形态观察·····························································13实验四潮间带实习及大型海藻采集·····················································17实验五大型海藻标本制作与保存·························································19实验六海洋底栖海藻形态观察·····························································21实验七海洋底栖动物形态观察·····························································27实验八海洋游泳动物形态观察·····························································29实验九海洋微生物宏基因组提取·························································39附录显微镜基本知识3实验一海洋生物的显微镜观察实验目的1、了解普通光学显微镜的构造。2、学习显微镜的正确使用维护。3、学习海洋生物形态的观察方法。材料和器具1、显微镜、载玻片、盖玻片、擦镜纸、香柏油、二甲苯、吸水纸、吸管。2、生物标本制片、海水水样实验内容（一）显微镜使用1、取镜打开镜箱、右手握住镜臂，取出显微镜，用左手托住镜座放于平稳的实验台上。镜检者姿势应端正，一般左眼观察，右眼便于绘图或记录。观察时两眼必须同时睁开，以减少疲劳。2、调光一般采用散射光，如光线弱时可用日光灯光作光源。（1）将低倍镜转至镜筒下方，旋转粗调节器，使镜头与载玻台相距0.5cm。（2）左眼看目镜，观察光源强弱，调节反光镜（一般用平面镜，若光线弱时可用凹面镜）、光圈与升降聚光镜使视野内光线均匀明亮。若用显微镜灯，则调节光源开关、光圈及升降聚光镜即可。3、低倍镜观察将待测标本置载物台上，用卡尺夹住，移动推动器，使观察标本处于物镜正下方。转动粗螺旋，使载物台上升（或4镜筒下降）至距标本0.5cm处，由目镜观察，然后慢慢下降载物台（或上升镜筒）直至出现模糊像后，用细调节器调至物像清晰为止。4、高倍镜观察低倍镜观察至清晰物像后，将观察的部位移至视野中央，转换高低镜，然后用细调节器调至物像清晰。5、油镜观察（1）在玻片标本的镜检部位滴一滴香柏油，然后将油镜转至正下方（2）小心上升镜台（或下降镜筒），从侧面注视镜头慢慢浸在香柏油中，几乎与标本相碰。应特别小心不能将油镜镜头压在标本上，更不能用力过猛以免压碎玻片或损坏镜头。（3）由目镜观察，全开虹彩光圈，调节光源使视野光线达到昀亮。（4）慢慢调节粗调节器，直至视野出现模糊物像为止，然后用细调节器调至清晰。如油镜头已离开油层而未见物像时，必须重复上述步骤。（5）观察完毕，下降载物台。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用一张擦镜纸沾少许二甲苯，擦去镜头上残留油迹，昀后用一张擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其它纸擦镜头，沾有香柏油的载玻片用废纸将油擦干，放在指定的地方以便统一处理。（二）生物标本制片分别在低倍镜、高倍镜和油镜下观察。青霉装片、酵母菌装片、枯草杆菌涂片（三）海水水样制片分别在低倍镜、高倍镜和油镜下观察。（四）显微镜复原：将光源调至昀小，关闭电源，拔下插头，将5连线折好收回，盖上防尘罩。做好使用登记后将显微镜放回。实验报告1、绘出你所观察的标本片生物示意图。2、为什么用油镜（100x）观察时要滴加香柏油？3、油镜观察后如何处理镜头？附录显微镜基本知识显微镜是微生物研究的工具，显微镜种类繁多，有光学显微镜、相差、暗视野、荧光及电子显微镜等。但它们的原理和结构基本相同。下面以普通光学显微镜为例简要介绍其原理及结构。（一）原理一般显微镜的光学系统由两部分组成（图1-1）（1）成像系统由目镜（a）、棱镜(b)、物镜（c）组成。物镜将标本作第一次放大，然后目镜再将第一次放大的实像作第二次放大。棱镜是专为改变光路用的，物镜光束经棱镜后转向与垂直方向成45°角。（2）照明系统由聚光镜（d）、可变光栏（e）、集光镜（f）和光源（g）组成。光源可选用自然或人工光源，人工光源由钨卤素灯发出，经集光镜平行光，然后聚光镜将外来光线聚在标本上，从而照明了标本，便于观察。（二）结构由光学部分（反光镜、聚光器、物镜和目镜）和机械部分（镜座、镜筒、镜臂、转换器、镜台、推动器、粗动螺旋和微动螺旋）组成（图61-2），主要部分件有：（1）目镜通常备有5×、10×、16×，一般选用10×。（2）物镜它对分辩力有着决定性影响。一般有低倍镜（10×）、高倍镜（40×）和油镜（100×），通常按顺序安装在转换器上。（3）聚光镜具有使样品明亮的集光作用，同时还影响物像的分辩力和反差，若将聚光镜的光圈开放到超过物镜的数值孔径时，便产生光斑，若收扰光圈，分辩力下降但反差增大。常用聚光镜为二透镜，N.A=1.2，并带有可变光栏和滤光片架。（4）载物台又称镜台，载放样品用。一般都装有一个推进器，可由移动手轮作横向或纵向移动载玻片。（5）粗调旋转是调节载物台或镜筒上下移动的装置。细调旋扭转动一圈的升降值为0.2mm，刻值为0.002mm。（二）显微镜性能1、数值孔径显微镜分辩力的高低决定于光学系统的各种条件，但起决定性影响的是物镜。物镜的性能可用数值孔径（N.A来表示）。数值孔径又叫开口率，它与显微镜的分辩力成正比，与焦深成反比，与镜像亮度平方根成正比。N.A=n.sina2式中：n——物镜与标本间的介质折射率。a——物镜的镜口角，即光源投射到透镜上的光线和轴之间的昀大夹角（图1-3）。事实上，a总是小于180°，所以sina的昀大值小于1。由于7空气的折射率为1所以，干燥物镜的数值也径总是小于1，一般为0.05-0.95，油镜物镜如用香柏油（折射率为1.515）作介质，则数值孔径昀大可接近1.5。虽理论上数值孔径的极限等于所用介质的折射率，但实际上从透镜的制造技术看是达不到的。退常在实用范围内，高级油镜的昀大数值孔径为1.4（图1-4）。2、分辨力分辨力系指分辨物体细微结构的能力。通常用（D）表示，D=λ，可见光波长为0.4-0.8μm，平均为0.55μm。若2N.A用数值孔径为0.65的物镜，则D=0.55=0.44μm这表明被检物体2×0.65或其上某结构在0.44或其上某结构在0.44μm以上时，以上时可被观察到，若小于0.44或其上某结构在0.44μm以上时，就看不清楚。若用数值孔径为1.25物镜，则D=0.22或其上某结构在0.44μm以上时，若被被检物大于此数值，即可视见，由此可见D值愈小，分辨力愈高，物像愈清晰。因此降低波长，增大折射和加大镜口角可提高分辨力。紫外光显微镜和电子显微镜就是利用短波光和电子波来提高分辨力以检视较小的物体。3、放大倍数显微镜放大倍数（V）等于物镜放大率（V1）和目镜放大率（V2）的乘积V=V2×V2。4、焦深在显微镜下观察一个标本时，焦点对在某一像面时，物像昀清晰，这像面为目的面。在视野内除目的面外，还能在目的面的上面和下面看见物像，这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深和开口率及放大率成反比，即开口率和放大率愈大，焦深愈小。因此调8节高倍镜比调节低倍镜要仔细，否则容易使物像滑过而找不到。9实验二海洋浮游植物形态观察预习报告1、蓝藻门、硅藻门、甲藻门、绿藻门的主要特征有哪些？2、海洋微藻有哪些形态特征与其浮游生活相适应？实验目的了解常见海洋微藻种类，掌握其分类特征材料和器具1、显微镜、载玻片、盖玻片、擦镜纸、香柏油、二甲苯、鲁哥氏液、吸水纸。2、钝顶螺旋藻、新月菱形藻、塔玛亚历山大藻、青岛大扁藻实验内容分别用低倍镜、高倍镜观察各门藻类结构（一）蓝藻门钝顶螺旋藻SpirulinaPlatensis：蓝藻门、蓝藻纲、藻殖段目、颤藻科、螺旋藻属Spirulina。藻体丝状，有规则螺旋，螺距的大小因种而异。藻体呈蓝绿色。细胞侧壁外胶质鞘不明显。常与丝状藻如颤藻混生，主要鉴别特征是藻体有规则的螺旋。常见形态如图：10（二）硅藻门新月菱形藻Nitzschiaclosterium：隶属硅藻门、羽纹硅藻纲、管壳缝目、菱形藻属，中文名新月菱形藻，俗称小硅藻。暖温性海洋硅藻类，分布于世界各海水、半咸淡水水域，我国各海区均有出现。藻体为单个细胞。细胞壁壳面中央膨大，纺锥形，两端渐尖，都朝同一方向弯曲，呈月牙状；细胞中央具一细胞核，有色素体2个，位于细胞中央细胞核两侧：细胞体褐色。细胞体长12～23微米、体宽2～3微米。新月菱形藻1000X（三）甲藻门11塔玛亚历山大藻Alexandriumtamarense：甲藻门，膝沟藻目，屋甲藻科，亚历山大藻属。细胞球形，长略大于宽。细胞长20-42μm，宽18-40μm。此种常形成有毒赤潮。该藻分布较广，在较暖的海域里发生赤潮的频率较高，我国海域在南海大鹏湾、厦门海域和胶州湾均有发现。塔玛亚历山大藻1000X（四）绿藻门青岛大扁藻Platymonashelgolandica：绿藻门，绿藻纲，团藻目，衣藻科，扁藻属，体长在16-30微米之间，宽12-15微米，厚7-10微米。单细胞椭球形，杯状色素体，4条鞭毛分成两组。青岛大扁藻1000X，右：鲁哥氏液染色，示鞭毛12实验报告1、绘出你所观察的各门代表物种的示意图（至少2种），并写出其分类地位。13实验三海洋浮游动物形态观察预习报告栉水母门、毛颚动物门主要结构特征实验目的了解常见海洋浮游动物种类，掌握其分类特征材料和器具1、显微镜、小烧杯、载玻片、盖玻片、擦镜纸、香柏油、二甲苯、放大镜、吸管、镊子。2、箭虫、球形侧腕水母浸制标本3、大型水蚤活体实验内容在放大镜下观察各浮游动物标本，在显微镜下观察外部结构。强壮箭虫（Sagittacrassa）：毛颚动物门(Chaetognatha)、箭虫属(Sagitta)。体细长，雌雄同体，生活时透明，固定后一般呈乳白色，身体被体腔内的横膈膜分成头部、躯干部及尾部。头部被一层可以伸缩的表皮称为头巾包围。头部左右两侧长有4-12根强大的几丁质呈镰刀状的颚毛。眼一对，位于头部中央。纤毛环位于头部背面脑的后方或向后方延伸至躯干部的前部，是由数列纤毛细胞形成的环状构造。触毛斑是体表有成堆的许多支持细胞及位于其中的纤毛细胞形成的略呈圆形或椭圆形的斑状点，分布于躯干背面，对称。纤毛环和触毛斑很容易染色。从头颈部横膈膜至肛门为其躯干部。从头颈部开始至躯干部，其表皮组织通常有一层扁平的细胞组成，在一定的部14位增厚为许多层，形成泡状组织。左右两侧有侧鳍，鳍内分布有鳍条。鳍条没有达到鳍的基部，形成无鳍条带。若有两对侧鳍，则前面的称前侧鳍，后一对横跨于躯干部及尾部之间，成后侧鳍。无游泳功能，仅有平衡身体的作用。尾末端有三角形尾鳍，也有鳍条为两侧有不同形状的突起，是贮精囊，仅在个体性成熟的时候才发达。强壮箭虫，右：头部400X15球形侧腕水母（Pleurobrachiaglobosa）：栉水母门，触手纲，球栉水母目，体呈球形，具有细长分枝且能所如触手鞘中的触手。大水蚤（Daphniamagna）：节肢动物门甲壳纲枝角目。躯体包被于两壳瓣中，体不分节，头部具一个大复眼。第二触角强大为双肢型，后腹部结构、功能复杂，胸肢４－６对兼具滤食、呼吸功能。对毒物十分敏感，是污水毒性试验的合适动物，同时可做污染水体的监测生物。此外，在药物微量测定、繁殖、育