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电泳迁移率实验技术（EMSA）主讲人：刘东凝胶迁移实验又称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验（EMSA，electrophoreticmobilityshiftassay），是一种用于蛋白与核酸相互作用的技术。最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验，也可应用于蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。一、实验原理EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发生互作。二、实验操作步骤1、实验前准备（1）合理的实验方案根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。（2）样本制备可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。（3）探针制备根据实验要求设计不同的探针并添加标记，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多。蛋白样本（2-5μg）Xμlpolyd(I-C)1μlBindingBuffer2μlNuclease-FreeddH2OXμl总体积9μl2、形成蛋白-探针复合物（1）在0.5ml离心管中按顺序将下列组份混匀：（2）冰浴5min后，加入1μl探针。（对照组加1ul对照探针）（3）PCR仪中室温（20-23℃）温育30min。3、制备凝胶，电泳（1）必须是非变性PAGE凝胶,一般用6.5%的非变性胶.制胶很重要,直接影响电泳的效果!一般控制在5分钟凝固的效果。(2）加样前先在预冷的0.5XTBEbuffer中120V预电泳10min，电泳完毕后冲洗加样孔。（3）混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。（4）将电泳槽置于冰上或者4℃环境中，恒压100V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm为止。（大约50-60min，根据实际情况调整电泳时间及电压；电泳时间不宜过长）10XTBE1.0ml40%Acrylamide(聚丙烯酰氨)3.3mldeionized,sterilewater14.8ml50%Glycerol（甘油）1.0mlTEMED（四甲基乙二胺）10μl脱气10min10%AP（过硫酸铵）120μl4、转膜（1）在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶，膜，滤纸和纤维垫。（2）按如下顺序组装“三明治”：纤维垫，滤纸，凝胶，膜，滤纸，纤维垫。注意电极，确保凝胶位于阴极、膜位于阳极。（3）在预冷的0.5XTBE中进行转膜。转膜装置应置于冰上或者低温室中，恒压60V转膜1h。（注意根据实际情况调整电压及时间）。5、紫外交联紫外交联仪是一种多用途的254mm紫外辐射系统主要用于将核酸交为使核苷酸固定在杂交膜上。传统的方法是将膜置于80℃真空烘箱中烘2小时，在本紫外交联仪上仅需在254nm紫外光下照射几秒钟即可。·紫外照射可使杂交信号比传统烘烤法提高5-10倍。5.洗涤、孵育用WashingBuffer洗涤(整个过程避免膜干燥)倒掉冲洗缓冲液，加入BlockBuffer轻微震荡20min加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素室温震荡孵育45min。（勿将酶标记物直接加到膜上）去掉酶联物稀释液，用WashingBuffer洗膜三次，每次室温轻微震荡10min。配置反应底物，均匀加至膜上，室温孵育5min。（可以在加完底物后，用薄膜轻轻覆盖在膜上，使底物均匀覆盖，注意不要产生气泡）6、曝光成像两种方法:化学发光数字成像与检测和感光胶片冲印成像用TNFa刺激肿瘤细胞后得到的核蛋白的NFKB的EMSA试验图片操作基本和Western试验操作相当,只是这个膜是一次性的,不能重复使用,一定保存好图片!由于跑得是非变性凝胶,蛋白保持天然构像和活性,所以条带很可能是一块一块的而不像WB那样很规整的一条细线,这个很正常。三、常见问题1、为什么看不到迁移带？1）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。2）样本中没有可以与探针结合的蛋白。3）探针与蛋白无特异性的相互作用。4）转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上。5）曝光或者成像时间过短。2、为什么实验背景高？1）曝光或者成像时间过长。2）封闭时间不足或者效率不高。3）洗涤效果不佳4）实验过程中膜没有一直处于湿润状态。3、EMSA测定需要多少量的蛋白与标记的探针？对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作优化：一般所用纯化蛋白的量在20-2000ng间，可将蛋白:DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍；用粗制核抽提液，需要2-10ug蛋白形成特异的复合物。部分纯化蛋白与粗制核抽提液应保存在-80℃、探针应保存在-20℃以防止降解。无论探针或是结合蛋白都应避免多次冻融！