EMSA

GelRetardationAssayElectrophoreticalMobilityShiftAssayEMSAGelMobilityShift凝胶迁移或电泳迁移率实验•概念•原理•实验步鄹•实验结果•优化因素主要内容是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。概念分类1同位素标记探针特点：特异性强、敏感性高达到10-18mol水平，对操作人员身体有害2非同位素标记探针------应用最为广泛特点：无需放射显影，采用生物发光或化学发光原理。灵敏度高，信号强原理放射性标记的DNABBABC细胞蛋白提取物B蛋白质与DNA结合BDNA-蛋白质结合物电泳迁移缓慢游离探针放射自显影凝胶电泳实验步鄹•探针的标记①:探针标记的反应体系(1.75pmol/μl)2μlT4PolynucleotideKinaseBuffer(10X)1μlNuclease-FreeWater5μl[γ-32P]ATP(3,000Ci/mmolat10mCi/ml)1μlT4PolynucleotideKinase(5-10u/μl)1μl总体积10μl②:使用水浴或PCR仪37℃反应10min.③:加一定体积的终止液、混匀、终止探针标记.④:加入一定体积的TE、混匀.Vortex混匀探针的纯化(视情况定）•对于100μl标记好的探针，加入一定量的醋酸铵和无水乙醇•在-70℃沉淀1h或在-20℃沉淀过夜•在4℃12000g-16000g离心30min弃上清•在4℃12000g-16000g离心1min、吸去残余液体•加入一定体积的TE,使沉淀溶解探针使用时间一般不超过3天，保存在-20℃EMSA胶的配制1、选择灌制较薄胶的模具2、按照如下配方配制4%的聚丙烯酰胺凝胶TBEbuffer(10X)1.0mlddH2O16.2mlAcr/Bis2ml80%甘油0.625ml10%AP0.150mlTEMED0.01mlEMSA结合反应1、如下设置EMSA结合反应阴性对照反应Nuclease-freewater7μl结合缓冲液（5X）2μl细胞核蛋白/纯化的转录因子0μl标记好的探针1μl总体积10μl样品反应Nuclease-freewater5μl结合缓冲液（5X）2μl细胞核蛋白/纯化的转录因子2μl标记好的探针1μl总体积10μl探针冷竞争反应Nuclease-freewater4μl结合缓冲液（5X）2μl细胞核蛋白/纯化的转录因子2μl未标记的探针1μl标记好的探针1μl总体积10μl突变探针冷竞争反应Nuclease-freewater4μl结合缓冲液（5X）2μl细胞核蛋白/纯化的转录因子2μl未标记的突变探针1μl标记好的探针1μl总体积10μlSuper-shift反应Nuclease-freewater4μl结合缓冲液（5X）2μl细胞核蛋白/纯化的转录因子2μl目的蛋白特异抗体1μl标记好的探针1μl总体积10μl2、按照上述顺序依次加入各种试剂，室温放置10min，加入标记好的探针，混匀，室温放置20min3、上样溴酚蓝的量尽可能少，能看到蓝颜色就可以电泳：10v/cm预电泳、10min10v/cm、温度≤30℃、溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳放射自显影干燥EMSA胶X光片压片检测实验结果12345实验结果Super-ShiftBandShift-BandFreeprobe典型的EMSA/Gel-Shift分析图1：阴性对照反应（标记探针）2：样品反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针)3：探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+标记探针100倍量的未标记探针)4：突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+标记探针100倍量的未标记突变探针)5：Super-Shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+目的转录因子的特异抗体)。成功关键因素1：实验设计根据实验目的、药物刺激的特性，确定药品浓度和时间梯度2：样品的制备专用蛋白抽提剂，确保活性和构象蛋白的纯度和浓度核酸酶、磷酸酶污染3：探针的制备探针的灵敏度4：制胶非变性PAGE凝胶4、结合反应蛋白的量（1-5μl)，根据蛋白的浓度定5、预电泳和电泳预电泳的电泳液更换Thankyou!