抗生素敏感实验

第三十四章抗微生物药物和敏感性试验陈文昭第一节临床常用抗菌药物抗菌药物（antibacterialagents）:具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。抗生素：细菌、真菌、放线菌等的代谢产物化学合成药物：经化学改造的半合成抗生素和化学合成药物抗菌药物：对病原微生物具有较高的“选择性毒性作用”对患者不造成损害抗菌药物的作用机制a.干扰细菌细胞壁的合成b.损伤细菌细胞膜c.影响细菌蛋白质的合成d.抑制细菌核酸的合成e.抑制细菌叶酸的代谢f.抑制结核环脂酸的合成一、青霉素类抗生素天然青霉素：青霉素G青霉素V不产青霉素酶的G+球菌和G-球菌耐青霉素酶青霉素：苯唑西林氯唑西林奈夫西林氟氯西林产青霉素酶的G+菌和G-球菌氨基组青霉素：氨苄西林阿莫西林等青霉素G敏感的细菌，大部分大肠、奇变、流感等G-菌。羧基组青霉素：替卡西林羧苄西林等氨苄西林无效的G-菌，产β-内酰胺酶的肠杆菌和假单胞菌有作用脲基组青霉素：美洛西林阿洛西林派拉西林等75％克雷伯菌、铜绿假单胞菌有抑制作用，肠杆菌、厌氧菌有好作用、对肠球菌和链球菌强于羧基组广谱青霉素：作用机制青霉素类抗生素作用于细胞壁合成后阶段的酶阻断肽聚糖合成的最后阶段—肽聚糖链的组装和三维结构的构建。该阶段由下面几种酶催化完成：转糖基酶、转肽酶、D-羧肽酶、内肽酶不同β-内酰胺类抗生素在不同程度上有抑制上述酶的作用二、头孢菌素类抗生素第一代头孢菌素：头孢噻吩、头孢唑啉等对G+菌有较强作用第二代头孢菌素：头孢呋辛、头孢克洛等对产β-内酰胺酶的G-杆菌有作用第三代头孢菌素：头孢噻肟、头孢他啶等对产β-内酰胺酶的G-杆菌有较强的作用第四代头孢菌素：头孢吡肟、头孢匹罗等对肠杆菌科细菌和铜绿假单孢菌作用强作用机制头孢菌素类抗生素和青霉素结合蛋白结合,抑制细菌细胞壁合成。PBP位于质膜，不同的头孢菌素与不同的PBP结合，发生不同的效应，使菌形成丝状体或球体，最终溶解死亡。三、其他β-内酰胺类抗生素单环-内酰胺类抗生素：氨曲南对G-杆菌作用强头霉素类：头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑对G+菌和产ESBLS有较好作用氧头孢烯类：拉氧头孢-氧头孢烯类衍生物对产β-内酰胺酶的G-杆菌有较强的作用，对产酶的金葡菌也有一定作用碳青霉烯类抗生素：亚胺培南、美洛培南等对G-杆菌（除嗜麦芽窄食单胞菌外）有很强的活性三、其他β-内酰胺类抗生素β-内酰胺酶抑制剂-与β-内酰胺类抗生素联用能增强后者的抗菌活性克拉维酸可从链霉菌培养液中分离得到舒巴坦半合成的酶抑制剂他唑巴坦半合成的酶抑制剂青霉素+β-内酰胺酶抑制剂四、氨基糖苷类抗生素链霉素、卡那霉素、妥布霉素、核糖霉素、巴龙霉素、新霉素庆大霉素、福提霉素阿米卡星、奈替米星、地贝卡星革兰阴性杆菌有强大的抗菌活性；革兰阴性球菌效果差；革兰阳性球菌有一定活性大观霉素、丙大观霉素：淋病奈瑟菌敏感，解脲脲原体敏感作用机制氨基糖苷类抗生素和细菌核糖体30S小亚基发生不可逆的结合，抑制MRNA的转录和蛋白合成；造成遗传密码子的错读，产生无意义的蛋白质；吸附在菌体表面，造成细胞膜的损伤，导致膜的渗漏，胞内的K+、腺嘌呤等物质外漏。喹诺酮类抗生素第一代喹诺酮类抗生素：奈啶酸等大肠杆菌有作用第二代喹诺酮类抗生素：环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等对G+菌和G-菌均有作用第三代喹诺酮类抗生素（超广谱类抗生素）：左氧氟沙星、司帕沙星等对G+菌（如MRS、PRSP、肠球菌）作用强于二代4-8倍作用机制作用于DNA旋转酶,干扰细菌DNA的修复和重组六、大环内酯类抗生素常用的有：红霉素、麦迪霉素等主要用于G+菌，对苛养菌及厌养菌有作用，对衣原体、支原体、立克次体、螺旋体等有抑制作用新一代大环内酯类抗生素：阿齐霉素、罗红霉素、克拉霉素、地红霉素等较红霉素有更强的抗菌活性作用机制大环内酯类抗生素可逆结合在细菌核糖体50S大亚基的23S单位上,抑制肽酰基转移酶,影响核蛋白位移,抑制细菌蛋白合成和肽链的延伸。七、四环素、氯霉素和林可酰胺类抗生素四环素类抗生素广谱抗生素米诺环素多西环素等四环素类抗生素主要与细菌30S核糖体亚单位结合，阻滞氨酰基转移RNA与信使RNA核蛋白体的受位位点的结合，阻滞肽链延伸，抑制蛋白质合成。七、四环素、氯霉素和林可酰胺类抗生素氯霉素类抗生素易进入脑组织氯霉素甲砜霉素氯霉素主要作用于细菌70S核糖体的50S亚基，使肽链延长受阻而抑制蛋白质合成。七、四环素、氯霉素和林可酰胺类抗生素林可酰胺类抗生素盐酸林可霉素克林霉素G+球菌、白喉杆菌、破伤风梭菌、厌氧菌、沙眼衣原体林可酰胺类抗生素与细菌50S核糖体亚基结合，抑制蛋白质合成，并可干扰肽酰基的转移，阻止肽链的延长。八、糖肽类抗生素万古霉素替考拉宁对G+球菌有强大的活性多粘菌素B和EG-菌强大的活性糖肽类抗生素与一个或多个肽聚糖合成中间产物D-丙氨酰-D-丙氨酸末端形成复合物，可阻断肽聚糖合成中的转糖基酶、转肽基酶及D-D羧肽酶的作用。磺胺类药物及增效剂用于全身感染，口服吸收好：磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺甲氧吡嗪；用于肠道，口服吸收差：柳氮磺胺啶银、磺胺二甲氧嘧啶；局部应用：磺胺米隆、磺胺醋酰钠作用机制磺胺类药物分子结构中含有对氨基笨磺酰胺，能竟争性地与二氢叶酸合成酶结合，阻止氨基苯甲酸与二氢叶酸合成酶结合，使菌体内核酸合成重要物质辅酶F（四氢叶酸）钝化而导致细菌生长受到抑制。甲氧苄胺嘧啶（TMP）能与二氢叶酸还原酶结合，抑制二氢叶酸还原酶，使二氢叶酸还原成四氢叶酸受阻而达到抑菌目的。其他合成抗菌药硝基呋喃类：用于肠道、尿路感染和外用呋喃坦啶、呋喃唑酮干扰细菌体内的氧化还原酶系统，阻断细菌的代谢，产生抑杀细菌的作用其他合成抗菌药硝基咪唑类：甲硝唑、替硝唑用于厌氧菌硝基咪唑类药物被厌氧菌还原而阻断DNA合成，从而阻止DNA的转录复制，导致细菌死亡。替硝唑可干扰DNA合成，并能穿透细胞膜，快速进入细胞内。第二节抗菌药物敏感性试验抗菌药物敏感性试验的意义试验常规抗菌药物选择抗菌药物敏感性试验的方法肉汤稀释法琼脂稀释法纸片琼脂扩散法E试验抗菌药物敏感性试验的意义预测疗效指导医生合理选择抗生素耐药监测，分析耐药变迁，掌握耐药菌感染的流行情况，控制预防耐药菌感染的发生和流行试验常规抗菌药物选择根据NCCLS标准：A组：常规首选药物B组：临床使用主要抗生素C组：对A组药物耐药的流行菌株，对A组过敏的病人和不常见的细菌U组：仅用于尿道中分离的细菌方法：肉汤稀释法常量稀释法和微常量稀释法培养基：M-H肉汤（苛养菌加添加剂）药物稀释药物原液制备稀释抗菌药物菌种接种（对数生长期，5X105CFU/ML）结果判断方法：琼脂稀释法培养基：M-H琼脂（苛养菌加添加剂）含药琼脂制备菌种接种（对数生长期0.5麦氏单位）结果判断方法：纸片琼脂扩散法试验原理：将含有抗菌药物的纸片贴于已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中药物吸收琼脂中水分后向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内，测试菌的生长被抑制，形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。纸片琼脂扩散法培养基：M-H琼脂抗菌药物纸片菌种接种结果判断和报告方法：E试验原理：结合稀释法和扩散法原理对微生物药物敏感性试验直接定量的技术E试条：无孔载体上固定有一系列预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。细菌接种和加样结果判断和报告EFBCADMICEtest法MICETST药物敏感性试验结果解释敏感：测试菌可被测定药物常规剂量给药后，在机体内达到的血药浓度所抑制或杀灭。耐药：测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制。中介：提示该细菌对常规用药后，体液或组织中的药物浓度的反应低于敏感株，但在一些部位（如尿液中的喹诺酮类）或使用高于正常给药量（如β-内酰胺类）临床上使用有疗效。联合药物敏感试验和杀菌试验联合药物敏感试验的意义治疗混合感染预防和推迟抗生素耐药性的发生可减少剂量以避免达到中毒剂量比单一用药时效果更好联合药物敏感试验和杀菌试验抗菌药物联合应用可出现4种结果：无关作用拮抗作用累加作用协同作用最低杀菌浓度测定监控抗生素的治疗效果试验血清抗菌药物浓度测定1、微生物测定法2、荧光偏振免疫测定3、高压液相层析法4、均相酶免疫测定法血清抗菌活性测定自动化仪器检测自动化仪器Microscan、Vitek都有测定MIC功能和检测ESBL的专用孔和专家系统。第三节细菌的耐药性和产生机制专题讲座第四节细菌的耐药性检查方法特殊耐药菌检测对MRSA/MRSE检测青霉素耐药的肺炎链球菌（PRSP）检测对万古霉素耐药的肠球菌(VRE)检测ESBLS检测Ampc检测一、MRSA/MRSE检测1、正确鉴定葡萄球菌2、MRSA/MRSE的鉴定高渗培养基（2~4%Nacl）较低的孵育温度（33~35摄氏度）时间：MRSA24hMRSE48h检测MRSA/MRSE的方法甲氧西林或苯唑西林筛选RSA/MRSE标准纸片扩散法微量肉汤稀释法甲氧西林或苯唑西林筛选MRSA/MRSEMH琼脂+4%Nacl+苯唑西林6μg或甲氧西林10μg用0.5McFarland菌液接种35℃孵育24h肉眼可见的菌落生长即为MRS标准纸片扩散法在M.H琼脂(2%Nacl)上用0.5McFarland的菌液划线接种。贴上甲氧西林或苯唑西林纸片（1μg），35℃孵育24h。苯唑西林抑菌圈小于或等于10mm。甲氧西林抑菌圈小于或等于9mm。微量肉汤稀释法M.H肉汤+2%Nacl+苯唑西林或甲氧西林。用0.5Mcfarland菌液接种，35℃孵育24hMIC：苯唑西林≥4μg/ml甲氧西林≥16μg/ml二、对青霉素耐药的肺炎链球菌（PRP）的检测筛选：苯唑西林纸片预测肺炎链球菌对青霉素的敏感性方法:用含1μg苯唑西林纸片,标准K—B法作药敏试验结果：抑菌环≥20mm敏感MIC≤19mm作肉汤或琼脂稀释试验测MIC药物的选择：青霉素、四环素、红霉素、TMP/SMZ、头孢菌素和万古霉素。肺炎链球菌对青霉素的敏感株(MIC:0.03-0.06μg/ml)对氨苄西林﹑阿莫西林﹑阿莫西林/克拉维酸﹑第二﹑三代头孢菌素和泰能敏感.肺炎链球菌对青霉素的MIC值≥1.0μg/ml的肺炎链球菌称为耐青霉素的肺炎链球菌(PRP)MIC值在0.12-1.0μg/ml之间的菌株为相对耐药(低耐)菌株(PIP)MIC≤0.6μg/ml为敏感株三、对万古霉素耐药的肠球菌耐药性可分为低水平耐药(MIC8-32mg/L)高水平耐药(MIC≥64mg/L)根据肠球菌对万古霉素和替考拉宁的不同耐药水平及耐药基因，VRE分为四个表型，分别是VanA﹑VanB﹑VanC﹑VanDVRE:的分型及其耐药表型类型万古霉素（μg/ml）替考拉宁VanAR（64-1000）R（16-512）VanBR（4-1024）S（0.25-2）VanCI（2-32）S(0.12-2)VanD（16-64）S（2-4）VRE的检测方法：稀释法，纸片扩散法Etest和自动化仪器VanA﹑B﹑C（Etest和琼脂筛选法最好，敏感率为100%）稀释法VRE筛选试验（琼脂稀释法）1、BHI琼脂+6ug/ml万古霉素2、用0.5Mcfarland菌液接种，35℃24h3、1个菌落R肉汤：生长RVRE筛选阳性必须做MIC确认，并观察动力和色素，以区分获得性耐药（VanA、VanB）,及某些菌种存在的固有的中介（8-16μg/ml）耐药（VanC）,两者在感染控制中意义不同。四、ESBLS检测（一）初筛试验1.仪器MIC≥2μg/ml2.纸片扩散法头孢泊肟或头孢他啶≤22mm头孢曲松≤25mm头孢噻肟或氨曲南≤27mm四、ESBLS检测（二）确证实验头孢他啶（CAZ）头孢他啶+克拉维酸（CAZ/CLV）头孢噻肟（CTX）头孢噻肟+克拉维酸（CTX/CLV）差值≥5mm确定为ESBLs五、A