[2]基因工程实验技术原理I(1)

第二节基因工程实验技术原理I授课教师：李旭授课时间：2014年9月19日青霉菌能产生对人类有用的抗生素家蚕能够吐出蚕丝为人类利用豆科植物的根瘤能够固定空气中的氮设想一能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让家蚕吐出蜘蛛丝？设想二能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等药物？生产蚕丝、蜘蛛丝？设想三经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术——基因工程。基因工程•基因工程（geneticengineering）–是利用DNA重组技术，将目的基因与载体DNA在体外进行重组，然后把这种重组DNA分子引入受体细胞，并使之增殖和表达的技术–基因工程可以改变生物原有的遗传特性获得新品种生产新产品基因工程的基本步骤•1.取得符合人们要求的DNA片段（目的基因）•2.构建基因的表达载体•3.将目的基因导入受体细胞•4.目的基因的检测与鉴定获取目的基因•从天然来源获取目的基因–限制性内切酶•人工合成目的基因–寡核苷酸合成技术–聚合酶链式反应（PCR）•目的基因的分离与收集–核酸凝胶电泳构建基因表达载体•基因表达载体–质粒、病毒、混合型载体•基因的拼接–DNA连接酶•基因的改造–定点突变技术将目的基因导入受体细胞•确定重组载体DNA序列的正确性–DNA测序技术•外源基因导入宿主细胞的方法–转化、转染、转导目的基因的检测与鉴定•目的基因是否转入宿主细胞–致死性及蓝白斑筛选–Southern印记法•目的基因是否转录出了mRNA–Northern印记法•目的蛋白质是否表达–SDS‐PAGE电泳结合肽指纹谱测序§2-1获取目的基因•§2‐1‐1从天然来源获取目的基因–限制性内切酶–生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶–它可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息§2-1-1从天然来源获取目的基因•限制‐修饰系统§2-1-1从天然来源获取目的基因•限制‐修饰系统–限制系统：限制性核酸内切酶–修饰系统：DNA甲基化酶（以大肠杆菌为例）•dam甲基化酶：在5‐GATC‐3序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基•dcm甲基化酶：在5‐CCAGG‐3或5‐CCTGG‐3中的胞嘧啶C5位置上引入甲基§2-1-1从天然来源获取目的基因•限制性内切酶分类–I型：•兼具限制、修饰两种功能•具有特定的识别位点，但没有特定的切割位点，一般切割位点距识别位点400bp以上，并对切割位点进行随机切割•很难形成稳定的特异的切割末端，在基因工程中没有应用价值§2-1-1从天然来源获取目的基因•限制性内切酶分类–II型：•其限制-修饰系统由两种酶组成：一是限制酶；二是独立的甲基化酶，它能修饰与限制酶识别位点相重叠的序列•有特定的识别序列，长度一般为4～6nt，且呈二重对称•有特定的酶切位点，能在其识别序列的特定位点处对双链DNA进行切割，产生特定的酶切末端§2-1-1从天然来源获取目的基因•限制性内切酶分类–II型：识别位点长度与出现频率•识别序列的频率=1/4N•Sau3A(4bp)=1/44256bp•EcoRI、PstI(6bp)=1/464096bp•NotI(8bp)=1/4865536bp(rarecutters)§2-1-1从天然来源获取目的基因•限制性内切酶分类–III型：•兼具限制、修饰两种功能•有特异的识别位点和切割位点，切割位点距识别位点3端24～26bp•因为已发现的Ⅲ型限制性内切酶种类太少，基因工程中不常用CGATGCATATTATACGGCTACGATGCATATTATACGGCTACGATGCATATTATACGGCTACGATGCATATTATACGGCTA§2-1-1从天然来源获取目的基因•限制酶切反应的关键因素–底物DNA的纯度和物理特性–反应系统–反应体积–孵育(保温)时间和温度§2-1-1从天然来源获取目的基因•限制酶的第二活性：星活性–星活性(staractivity)是指严格典型的识别序列特异性被放宽而导致在DNA内产生附加的切割，在该酶名称的右上角加星号表示之。如EcoRⅠ的识别序列为GAATTC，EcoRⅠ*的识别序列放宽为AATT。–造成星活性的因素有：甘油浓度、离子强度、pH值、有机溶剂、二价阳离子、酶与DNA之比§2-1-1从天然来源获取目的基因•保护碱基–内切酶在切断DNA时，如果酶切位点在末端时，外侧必须还有若干个碱基内切酶才能发挥作用，外侧这几个碱基就叫做保护碱基–不同内切酶保护碱基个数不同§2-1-1从天然来源获取目的基因酶寡核苷酸序列切割率%2hr20hrAccIGGTCGACCCGGTCGACCGCCGGTCGACCGG000000AflIIICACATGTGCCACATGTGGCCCACATGTGGG0909009090AscIGGCGCGCCAGGCGCGCCTTTGGCGCGCCAA909090909090AvaICCCCGGGGCCCCCGGGGGTCCCCCGGGGGA509090909090BamHICGGATCCGCGGGATCCCGCGCGGATCCGCG109090259090§2-1-1从天然来源获取目的基因酶寡核苷酸序列切割率%2hr20hrBglIICAGATCTGGAAGATCTTCGGAAGATCTTCC0752509090BssHIIGGCGCGCCAGGCGCGCCTTTGGCGCGCCAA00500090BstEIIGGGT(A/T)ACCC010BstXIAACTGCAGAACCAATGCATTGGAAAACTGCAGCCAATGCATTGGAACTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT0252505090ClaICATCGATGGATCGATCCCATCGATGGCCCATCGATGGG009050009050§2-1-1从天然来源获取目的基因酶寡核苷酸序列切割率%2hr20hrEcoRIGGAATTCCCGGAATTCCGCCGGAATTCCGG909090909090HaeIIIGGGGCCCCAGCGGCCGCTTTGCGGCCGCAA909090909090HindIIICAAGCTTGCCAAGCTTGGCCCAAGCTTGGG00100075KpnIGGGTACCCGGGGTACCCCCGGGGTACCCCG0909009090MluIGACGCGTCCGACGCGTCG025050§2-1-1从天然来源获取目的基因酶寡核苷酸序列切割率%2hr20hrNcoICCCATGGGCATGCCATGGCATG050075NdeICCATATGGCCCATATGGGCGCCATATGGCGGGGTTTCATATGAAACCCGGAATTCCATATGGAATTCCGGGAATTCCATATGGAATTCCC0000757500009090NheIGGCTAGCCCGGCTAGCCGCTAGCTAGCTAG0101002550NotITTGCGGCCGCAAATTTGCGGCCGCTTTAAAATATGCGGCCGCTATAAAATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATAAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA010102525010109090§2-1-1从天然来源获取目的基因酶寡核苷酸序列切割率%2hr20hrNsiITGCATGCATGCACCAATGCATTGGTTCTGCAGTT10909090PacITTAATTAAGTTAATTAACCCTTAATTAAGG00002590PmeIGTTTAAACGGTTTAAACCGGGTTTAAACCCAGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG000750255090PstIGCTGCAGCTGCACTGCAGTGCAAACTGCAGAACCAATGCATTGGAAAACTGCAGCCAATGCATTGGAACTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT0109090001090900§2-1-1从天然来源获取目的基因酶寡核苷酸序列切割率%2hr20hrPvuICCGATCGGATCGATCGATTCGCGATCGCGA010002510SacICGAGCTCG1010SacIIGCCGCGGCTCCCCGCGGGGA050090SalIGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGCGCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGGACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA0101005075ScaIGAGTACTCAAAAGTACTTTT10752575§2-1-1从天然来源获取目的基因酶寡核苷酸序列切割率%2hr20hrSmaICCCGGGCCCCGGGGCCCCCGGGGGTCCCCCGGGGGA00109010105090SpeIGACTAGTCGGACTAGTCCCGGACTAGTCCGCTAGACTAGTCTAG10100090905050SphIGGCATGCCCATGCATGCATGACATGCATGCATGT001002550StuIAAGGCCTTGAAGGCCTTCAAAAGGCCTTTT909090909090§2-1-1从天然来源获取目的基因酶寡核苷酸序列切割率%2hr20hrXbaICTCTAGAGGCTCTAGAGCTGCTCTAGAGCACTAGTCTAGACTAG09075750909090XhoICCTCGAGGCCCTCGAGGGCCGCTCGAGCGG0101002575XmaICCCCGGGGCCCCCGGGGGCCCCCCGGGGGGTCCCCCCGGGGGGA02550900759090§2-1-1从天然来源获取目的基因•限制性内切酶使用注意事项–同裂酶–特异性甲基化及星活性–合适的酶浓度–多酶切提高效率§2-1获取目的基因•§2‐1‐2人工合成目的基因–§2‐1‐2‐1寡核苷酸合成技术–由于高效、快速以及起始材料非常稳定，脱氧核苷亚磷酰胺(Phosphoramidite)方法成为寡聚核苷酸化学合成的首选•通过受保护的亚磷酰胺核苷的3′端磷酸基团与固定在载体上的核苷酸5′末端羟基的酯化偶联一个碱基实现逐步合成•合成方向为3′→5′，与酶促反应相反OSODMT5’         3’OSOHO5’         3’OSOP5’         3’OSODMT5’         3’ORPOSODMT5’         3’ORNR2OSOP5’         3’OSODMT5’         3’ORIIOOSOP5’         3’OSOHO5’         3’ORIIO去保护偶联氧化，稳定磷酸二酯键去保护进入下一循环SSolidCPGsupportRibose/deoxyribosesugarProtectedbase§2-1-2-1寡核苷酸合成技术§2-1获取目的基因•§2‐1‐2人工合成目的基因–§2‐1‐2‐2聚合酶链式反应（PCR）§2-1-2-2聚合酶链式反应•PCR的基本步骤–变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链–退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对–延伸(Extension)：DNA模板‐引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链§2-1-2-2聚合酶链式反应1.Denature100℃,1min2.AnnealPrimers50-65℃,1min3.Polymerization72℃,1-3min4.DSDNAAnnealing§2-1-2-2聚合酶链式反应§2-1-2