核苷酸

核苷酸类物质生产工艺一、概况核酸由众多的单体核苷酸通过3,5’－磷酸二酯键聚合而成。核苷酸由碱基、核糖、磷酸组成。（一）呈味核苷酸核苷酸类中的肌苷酸（IMP）、鸟苷酸（GMP）、黄苷酸（XMP）呈强鲜味。如：肌苷酸钠比味精鲜40倍，鸟苷酸钠比味精鲜160倍。5’－鸟苷酸5’－肌苷酸5’－黄苷酸（guanylicacid）（inosinicacid）（xanthylicacid）5’-GMP5’-IMP5’-XMP鲜味剂的协同效应当核苷酸与氨基酸类物质混合使用时，鲜味不是简单的叠加，而是成倍地提高。新型鲜味剂动物蛋白水解物植物蛋白水解物酵母抽提物（酵母精）新型鲜味剂通过生物技术将动植物水解，水解液富含各种氨基酸、短肽、核酸、维生素，可以保有原有的营养，更易为人体所吸收，更具有一定的保健作用。例如鸡精，除含有鸡肉粉、鸡蛋粉。又添加了水解蛋白、呈味核酸等。历史•1960年，日本科学家发现5‘-IMP具有强烈鲜味。•60年代后期，日本成为用发酵法生产核苷酸类物质的最大生产国。•市场上的“强力味精”、“加鲜味精”是在普通的味精中加少量肌苷酸钠组成。•70年代以后，核酸类物质及其衍生物以其具有抗病毒和抗肿瘤的作用，受到医药界的普遍重视。•肿瘤化学治疗中常用的5-氟尿嘧啶及6-巯基嘌呤等。（二）生产方法1.发酵法（1）一步法：直接发酵法（2）二步法（发酵转化法）发酵法核苷核苷酸2.酶解法酵母核糖核酸核苷酸提取酶解磷酸化二、核苷酸的生物合成途径及其代谢调控（一）生物合成途径1.从头合成途径（denovosynthesis）由氨基酸、磷酸戊糖、CO2和NH3合成核苷酸。嘌呤核苷酸：直接生成次黄嘌呤核苷酸（IMP）,然后转变为其它嘌呤核苷酸。葡萄糖HMP5‘－磷酸核糖磷酸核糖焦磷酸（PRPP）PRPP转酰胺酶5’-IMPAMPSAMPXMPGMPCONHCHNCCNCHNR-5'-PNHCHNCCCNCHNR-5'-PNHHOOCCH2CHCOOHNCHNCCCNCHNR-5'-PNH2OCNHNHCCCNCHNR-5'-PONHCNCCCNCHNR-5'-POH2N延胡索酸腺苷酸代琥珀酸裂解酶腺苷酸代琥珀酸AMPIMPNAD+H2ONADH+H+XMPGMP合成酶谷氨酰氨Mg2+,ATP谷氨酸GMP由IMP合成AMP及GMP2.补救合成途径（salvagesynthesis）微生物从培养基中取得完整的嘌呤、戊糖、磷酸，直接合成单核苷酸。当全生物合成途径受阻时，微生物可通过此途径合成核苷酸。三、肌苷酸的生产（一）一步法1.肌苷酸生产菌选育（1）解除微生物自身的反馈调节a.解除AMP、GMP对PRPP转酰胺酶的反馈抑制。b.切断5‘-IMP继续代谢生成GMP和AMP的途径。因此，选择可能产生核苷酸的产氨短杆菌（Brevibacteriumammoniagene）为出发菌株，诱变为腺嘌呤缺陷型突变株，再诱变为鸟嘌呤缺陷型突变株。IMP的阻遏如何解决？（2）改变核苷酸对细胞膜的渗透性核苷或碱基容易透过细胞膜，而核苷酸难于透过细胞膜。日本科学家发现，Mn2+对于产氨短杆菌核苷酸的膜透性起着关键作用，Mn2+限量的情况下，菌体产生膨胀异常现象，细胞膜允许IMP渗透到胞外，积累IMP。Mn2+限量与生物素亚适量结果相同，但机制不同。Mn2+亚适量：培养后期，细胞形态异常（伸长、膨胀、不规则）生物素亚适量：为乙酰CoA羧化酶的辅基，影响脂肪酸生物合成，间接影响细胞膜磷脂合成，从而影响细胞膜透性。2.培养条件（1）因所用菌株为腺嘌呤缺陷型，所以添加适量腺嘌呤（加0.5%酵母膏或酵母水解液）。（2）Mn2+亚适量工业原料和工业用水含较多的Mn2+，难于控制Mn2+亚适量,有两条途径：a.筛选对Mn2+不敏感的突变株b.加抗生素或表面活性剂以解除过量Mn2+的影响。（3）添加较高浓度的磷盐。（二）二步法（肌苷酸生产主要方法）发酵法肌苷肌苷酸原因：•IMP对细胞膜的透性很差。•微生物中普遍存在使IMP脱磷酸化的酶类。磷酸化1.肌苷生产菌的选育常用：Bacillussubtilis的腺嘌呤缺陷型。原因：该菌磷酸酯酶活性强，有利于将IMP脱磷酸化形成肌苷，分泌至胞外，而产氨短杆菌的磷酸酯酶活性较弱。2.培养条件（1）培养基：碳源：淀粉水解糖或糖蜜氮源：要充分（因肌苷含氮量高，20.9％）无机盐：可溶性磷盐有抑制作用（胞外磷酸化）生长因子：加适量含腺嘌呤的物质，如酵母膏。腺嘌呤的最适浓度：不影响菌体生长使肌苷大量积累（2）发酵条件通气搅拌：供氧充足，促进肌苷生成，并可减少CO2对肌苷生成的抑制。（3）肌苷的提取先过阳离子交换柱，再过活性炭柱（吸附），结晶。3.肌苷的磷酸化（1）酶法：酶：核苷磷酸化酶（三叶草假单胞菌）磷酸的供体：对硝基苯磷酸难点：除5‘－磷酸化产物外，还有3’-、2‘-位异构体，收率85％。（2）化学法：用不同的磷酸化试剂。4.肌苷酸的提取离子交换法除菌体除对硝基酚柱层析（过滤、离心）活性炭吸附加乙醇沉淀精制（结晶）粗制品肌苷酸四、鸟苷酸的生产•鸟苷酸由鸟嘌呤、核糖和磷酸三部分组成。•1960年，日本科学家发现5‘－鸟苷酸钠具有强烈的鲜味。1961年又证实了香味极浓的著名菇类－香菇含有大量的鸟苷酸，从此开始研究GMP的生产方法。（一）二步法（常用）原因：1.GMP的细胞膜透性很差（限Mn2+）微生物中普遍存在鸟苷酸的降解酶系（加高浓度磷盐）,培养条件较复杂。2.直接发酵法产酸率不高，因GMP是嘌呤核苷酸生物合成的终产物，使鸟苷酸的自身合成受阻。3.鸟苷的溶解度低，容易析出，相对减弱了反馈调节的强度，使积累鸟苷成为可能。鸟苷生产菌的选育（鸟苷高产菌株应具备的条件）（1）丧失腺苷酸琥铂酸合成酶活性，即切断肌苷酸到腺苷酸的通路。（2）鸟苷分解酶的活性微弱。（3）解除鸟苷酸的反馈抑制与阻遏。（4）由肌苷酸脱氢酶、鸟苷酸合成酶催化的反应，比核苷酸酶催化的反应优先进行，从而抑制肌苷的产生。利用枯草芽孢杆菌腺嘌呤缺陷型加以诱变获得。CONHCHNCCNCHNR-5'-PNHCHNCCCNCHNR-5'-PNHHOOCCH2CHCOOHNCHNCCCNCHNR-5'-PNH2OCNHNHCCCNCHNR-5'-PONHCNCCCNCHNR-5'-POH2N延胡索酸腺苷酸代琥珀酸裂解酶腺苷酸代琥珀酸AMPIMPNAD+H2ONADH+H+XMPGMP合成酶谷氨酰氨Mg2+,ATP谷氨酸GMP由IMP合成AMP及GMP（二）酶法（又称核酸水解法）起始于日本，50－60年代研制成功，技术关键是筛选到产生5‘－磷酸二酯酶（核酸外切酶）的菌株。1.原理5’－磷酸二酯酶能水解核糖上3‘－碳原子羟基与磷酸形成的二酯键，生成4种5’－单核苷酸，即：从游离3‘－羟基端开始，逐个水解下5’－单核苷酸。特点：工艺简单，得率高，副产物也为医药产品。核酸的降解过程核酸酶（磷酸二酯酶）核苷酸酶（磷酸单酯酶）核苷磷酸化酶核酸核苷酸核苷磷酸嘌呤或嘧啶戊糖-1-磷酸某些核酸外切酶对RNA、DNA均有作用：牛脾磷酸二酯酶3-核苷酸蛇毒磷酸二酯酶5-核苷酸2.磷酸二酯酶的制备（1）桔青霉（Penicilliumcitrinum）可用固体发酵（制曲、浸泡、抽提）（2）金色链霉菌（Streptomycesaureus）液体深层发酵，该菌不仅含有5‘－磷酸二酯酶，同时含有脱氨酶，使其中的5’－AMP脱氨后生成5‘-IMP。因此，使用该菌产生助鲜剂时，由于含有两种酶，可同时得到IMP和GMP。3.核酸提取（1）鲜酵母制备（2）提取核酸（RNA）4.核酸酶解核酸溶液5‘－单核苷酸混合液5.5‘－鸟苷酸的分离离子交换树脂5‘－磷酸二酯酶