生物工艺学第1章-核酸的制备

第一章核酸的制备1.1DNA的组成和结构（略）1.2天然DNA的制备1.2.1天然DNA的来源和用途线粒体和叶绿体DNA质粒DNA病毒和噬菌体DNA染色体DNA天然DNA1.2.2天然DNA的提取准备生物材料裂解细胞分离和抽提DNA核酸分离纯化的基本步骤制备细胞及破碎细胞消化蛋白质,去除生物大分子去除不需要的核酸分子沉淀核酸,去除杂质尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。抑制核酸酶。A、供体的核酸分离供体细胞培养收集(菌体)细胞细胞破碎分离总DNA分离细胞器分离总RNA分离细胞器DNARNApoly(A)RNA特异性RNA染色体DNA(组建基因组文库)B、载体DNA分离载体DNA感染或转染细胞（病毒型）转化细菌细胞（质粒型）分离病毒颗粒培养转化细胞、收集菌体病毒载体DNA分离与纯化破碎细胞质粒DNA分离与纯化C、DNA片段的分离DNA限制酶切凝胶电泳分离特定DNA片段的回收1、准备生物材料选择生物种类；选择DNA易提取和含量高的组织；选择DNA得率最高的生长期。如:大肠杆菌质粒DNA：应在对数生长期后期。植物DNA：选幼嫩植株或黄化幼苗。肝脏DNA：要清除胆囊。2、裂解细胞这步是关系到能否提取到DNA以及DNA得率高低和质量的关键步骤。原核细胞：用溶菌酶，NaOH和SDS，煮沸，冰冻，超声波等方法；结构复杂的动、植物材料：先必须粉碎（液氮冻结后研磨，或捣碎机、研钵直接粉碎），再参照裂解原核的方法。3、分离和抽提DNA提取总DNA：在裂解液中加适量酚／氯仿／异戊醇或氯仿／异戊醇等有机溶液，使DNA与蛋白质分开，用乙醇或异丙醇沉淀DNA，再离心。提取叶绿体或线粒体等细胞器DNA以及病毒和噬菌体的DNA：须先从裂解液中分离完整细胞器、病毒和噬菌体，抽提前必须经DNase处理，水解附着于其表面的其它DNA。提取质粒DNA：调节裂解液pH12.6，所有DNA都变性沉淀，再调节PH至中性，质粒DNA复性后从沉淀物中释出。除RNA：用RNase水解除RNA，分离抽提DNA最有效的方法：氯化铯梯度离心（氯化铯溶液中加适量溴化乙锭，紫外灯下DNA带和RNA带都发荧光，但沉降系数明显不同而聚集于不同的氯化铯密度区）1.2.2.1大肠杆菌源质粒DNA的提取碱裂解法*：原理：细菌悬浮液暴露在高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心去除后，就可从上清中回收质粒DNA。实验步骤①挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养，用无菌牙签或挑种环挑取单菌落于20ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，于37℃剧烈振摇下培养过夜。②将1.2ml培养物倒入微量离心管中，于4℃以5000g离心5min（两次）。③吸取并弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。④将细菌沉淀重悬于100μl溶液Ⅰ中，剧烈振荡。⑤加200μl溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。确保离心管的整个表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡！将离心管放置与冰上5min。⑥加150μl溶液Ⅲ，盖紧管口，将管倒置，温和振荡20s，使溶液Ⅲ在黏稠的细菌裂解液中分散均匀，之后将管置于冰上5min。⑦4℃离心12000g，5min，上清转移至另一离心管中。⑧加等体积酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），振荡混匀。⑨4℃离心12000g，5min，上清转移至另一离心管中。⑩用2倍体积无水乙醇于室温沉淀质粒DNA，振荡混匀，于室温放置2min。114℃离心12000g，5min。小心吸去上清夜，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。12用1ml70％乙醇溶液洗涤沉淀，4℃离心12000，5min，弃去上清，在空气中使核酸沉淀干燥。13用50μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μlg/ml）的TE重新溶解核酸，振荡，贮存于-20℃。试剂：（1）溶液Ⅰ：50mmol/l葡萄糖25mmol/lTris-HCl（pH8.0）10mmol/lEDTA-Na2（pH8.0）5mg/ml溶菌酶（临用时加）（2）溶液Ⅱ（新鲜配制）：200mmol/lNaOH1%（W/V）SDS（3）溶液Ⅲ（100ml）：5mol/lKAc60ml冰乙酸11.5ml（pH4.8）ddH2O28.5ml1.2.2.2λ噬菌体DNA的提取溶源周期溶菌周期提取λDNA的原理：先将溶源菌培养至一定密度，通过热诱导，使λDNA从宿主染色体DNA上释放出来，再经过溶菌周期培养，获得大量λ噬菌体，从中提取线形的λDNA。提取过程：①溶源菌诱导培养②分离λ噬菌体③λDNA的提取1.2.2.3氯化铯法制备植物基因组DNA①材料准备②细胞裂解③DNA分离抽取1.2.3DNA的纯化2.2.3.1氯化铯－溴化乙锭连续梯度离心法2.2.3.2离子交换层析法用三烃甲基氯化铵层析树脂纯化DNA用羟基磷灰石纯化DNA2.2.3.3琼脂糖凝胶电泳洗脱法2.2.3.4“基因纯”试剂纯化2.2.3.5从DNA样品中去掉EB正丁醇（或异戊醇）抽提法Dowex树脂层析法1.2.4DNA的浓缩乙醇沉淀法含一价阳离子的DNA溶液＋2体积无水乙醇→沉淀DNA→离心→溶于适量TE缓冲液或无菌水。条件：-20℃，30min以上；小于1kb或量较少时，于-70℃沉淀，或延长时间。正丁醇抽提法DNA溶液＋1体积正丁醇→混匀→离心（1600r/min1min）→弃上清→重复至所需体积→用水饱和乙醚抽提DNA溶液两次（除正丁醇）→空气中蒸发乙醚。聚乙二醇浓缩法DNA溶液→透析袋→置高浓聚乙二醇溶液→4℃浓缩至所需体积。1.3RNA的分离与纯化(一)总RNA的提取提取方法:异硫氰酸胍-氯化铯超速离心法、盐酸胍-有机溶剂法、快速提取法原理：1、异硫氰酸胍-氯化铯超速离心法：异硫氰酸胍为强蛋白质变性剂，有效抑制了RNA酶活性。将其溶于组织悬浮液中，等悬浮组织细胞匀浆后，即可进行密度梯度超速离心。缺点：对分子量较小的5SRNA及tRNA不能有效沉淀，且要求有超速离心机。2、盐酸胍-有机溶剂法利用盐酸胍匀浆组织细胞，同进抑制RNA酶活性，应用氯仿等有机溶剂变性并去除蛋白质，继而选择性沉淀RNA。（二）mRNA的分离与纯化分离方法：从总RNA中进一步分离纯化mRNA\从细胞匀浆中直接分离和制备mRNA\利用真核细胞中mRNA末端含有PolyA顺序,采用Oligo(dT)纤维素柱或PolyU琼脂糖柱的亲和层析。原理：当细胞总RNA通过Oligo(dt)亲和层析柱时，PolyARNA滞留于柱中，而其它的RNA则被洗掉。对柱中的PloyARNA进行洗脱，即将其纯化出来。★RNase的灭活：玻璃器皿：140-200，8塑料器皿：0.1%DEPC，37，过夜提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍反应体系中加RNasin等特异的RNase抑制剂★用0.14mol/LNacl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。盐酸胍、苯酚等去蛋白★异硫氰酸胍/苯酚/氯仿法★异硫氰酸胍/氯化铯密度梯度离心法蛋白质：＜1.33g/mlDNA：1.71g/ml左右RNA：＞1.89g/ml★mRNA的制备：oligo(dT)纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法1.4特异性DNA片段的PCR扩增聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）即PCR技术，由美国科学家Mullis于1983年发明，又称基因的体外扩增法。也有人称无细胞分子克隆法。PCR技术的用途目的基因的扩增与分离；医疗诊断；基因突变与检测；分子进化研究；环境检测；法医鉴定。§1PCR的基本原理一、基本原理变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚CTm=4(G+C)+2(A+T)90～95℃30’’～1’37～60℃30’’～1’70～75℃30’’～2’二、“长产物片段”和“短产物片段”“短产物片段”是严格地限定在两个引物链5’端之间的，正是需要扩增的特定片段；“长产物片段”则带有不需要的“尾巴”。“短产物片段”是按指数倍数增加的；而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计。三、平台效应在PCR反应中，当引物－模板与DNA聚合酶达到一定比值时，DNA聚合酶催化的反应趋于饱和，会出现“平台效应”，即PCR反应产物不再增加。平台效应出现的迟早主要取决于起始模板的拷贝数、所用的DNA聚合酶的性能及底物dNTP的浓度等多种因素。§2PCR反应条件的优化一、标准PCR反应流程（一）反应体系标准PCR反应体系为50～100μl，其中包含：①1×PCR反应缓冲液②4种dNTP：各200μM③两种引物：各0.25μM④DNA模板：0.1μg⑤TaqDNA聚合酶：2U（二）反应步骤二、PCR反应条件的优化特异性、有效性和忠实性是检验PCR扩增效率的三个指标。PCR反应的主要影响因素有：（一）循环参数（反应温度与时间）1.变性2.退火3.延伸4.循环次数（二）PCR反应成分1.TaqDNA聚合酶2.引物3.dNTP4.缓冲液5.模板6.其它因素①高温启动②添加剂§3引物的设计一、设计原则PCR扩增引物：是指与待扩增DNA区域两端序列互补的人工合成的寡核苷酸短片段，其长度通常在15～30个核苷酸之间。它包括引物1和引物2。引物1：又称Watson引物，是5’端与正义链互补的寡核苷酸，用于扩增编码链或mRNA链。引物2：又称Crick引物，是3’端与反义链互补的寡核苷酸，用于扩增DNA模板链或反密码链。引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。具体的设计原则见书P57。二、引物长度引物太短→可能同非靶序列杂交，得出非预期的扩增产物。引物过长→引物同模板DNA的杂交速率下降，结果在反应循环周期内无法完成同模板DNA的完全杂交，从而减低PCR反应的效率。三、引物的5’端修饰法1.5’端附加核酸序列2.功能基团修饰法①放射性核素（修饰三磷酸）②非放射性分子（修饰碱基）§4耐热DNA聚合酶一、TaqDNA聚合酶1.热稳定性2.无3’→5’外切酶活性3.反转录活性4.非模板依赖的聚合活性5.影响酶活性的因素二、其它耐热DNA聚合酶（见书P56）1.PwoDNA聚合酶2.TthDNA聚合酶3.C.therm.聚合酶4.ventDNA聚合酶*5.PfuDNA聚合酶*1.5DNA片段的化学合成1.5.1寡核苷酸片段的化学合成的方法1.磷酸二脂法2.磷酸三脂法3.固相亚磷酸三脂法（常用）1.5.2化学方法合成的DNA片段化学方法可合成DNA互补链的引物、寡核苷酸连杆以及基因片段和元件等。1.合成DNA互补链的引物除PCR引物外，还有测序引物。见下表。2.DNA寡核苷酸连杆（linker）linker：是指用化学方法合成的一段由10~20个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。linker经限制酶切割后可产生一定的粘末端，可与另一有相同粘末端的DNA片段连接。（附图）化学合成的寡核苷酸中，有的含有一个反向重复序列而形成一个双链发夹结构。在双链部分有一种限制性核酸内切酶的识别序列，切割后产生一定的粘末端或平末端。这种寡核苷酸可兼作连杆和引物，即测序引物连杆。由几十至上百个核苷酸组成，有多种限制酶的识别序列，可作为连杆且被组装在克隆载体上成为多克隆位点（MCS）。这种连杆即多克隆位点寡核苷酸连杆或简称MCS连杆。（附图）3.衔接头（adaptor）adaptor：它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。（附图）4.DNA芯片DNA芯片：是DNA片段以预先设计的排列方式固定在载玻片或尼龙膜上组成的密集分子排列。1.6DNA片段大小的凝胶电泳检测方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶电泳和脉冲场凝胶电泳等方法。