第十四章-甾体激素的微生物转化工艺

第十四章甾体激素的微生物转化工艺第一节概述第二节微生物转化反应原理第三节甾体激素的生产工艺过程化学工业出版社学习目标了解甾体激素种类及其微生物转化反应原理；熟悉甾体激素的生产工艺过程；掌握氢化可的松的生产技术。第一节概述认识甾体激素甾类药物是指分子结构中含有环戊烷多氢菲核的一类药物，在医学上应用非常广泛，特别是甾体激素类药物，应用在风湿性关节炎，控制炎症，避孕，利尿等各方面的治疗上，对机体起着非常重要的调节作用。甾类激素根据其生理活性可分为肾上腺皮质激素，性激素和蛋白同化激素三大类。甾体化合物的基本结构如下：1716151413121110987654321ABCD图14-1甾体化合物的基本结构甾类激素药物的生产，目前一般采用化学合成和微生物转化两种方法相结合的生产工艺。第二节微生物转化反应原理微生物几乎对甾体每个位置都能进行转化，其中对甾体激素药物合成比较重要的主要有氧化反应、还原反应、水解反应等。其中氧化反应又包括甾体骨架上的羟基化和脱氢（生成双键）、甾醇氧化成甾酮、支链降解作用以及D环的切断和D环开裂形成内酯环等。羟化反应C9α羟化C9α羟化在甾体药物合成中是一个关键中间步骤，涉及到甾体边链的选择性降解，并且是皮质激素合成中一个关键中间体。由于C9位上导入羟基后，容易在C9—C10之间引入双键，然后进一步形成C11β羟基或导入氟原子。例如甾体合成中重要中间体9α-羟基-4-雄甾烯-3，17双酮和9α-羟基-3氧化娠烷-4，17双烯-20羧酸的制取。C11α羟化C11α羟化是微生物转化的特有反应。如孕酮的转化中，利用黑根霉在温度不超过320C时实现C11α羟基化反应。温度的控制很重要，生产过程中温度超过320C，黑根霉只会大量生长菌丝而不对孕酮进行C11α羟化。过程伴随有微量副产物出现。环氧化反应用微生物转化法在甾体母核上引入环氧基团的反应与微生物羟基化有关。能产生11β-羟基化的新月弯孢霉或布氏小克汉银霉都可将17α，21-二羟基-4，9（11）-孕甾二烯-3，20-二酮转化成9β，11β环氧化合物。脱氢反应微生物对甾体C1，C2位是直接脱去C1，C2位上的氢。微生物对甾体羟化与脱氢能力是相反的，细菌的脱氢能力比真菌大，特别是棒状杆菌和分枝杆菌活力最大。球形芽孢杆菌，诺卡氏菌对可的松和皮质醇也有较高的脱氢活力。而对甾体母核有脱氢活力的微生物，常伴随边链降解和C26位酮基还原以及其C9α羟化引起β环打开等作用。甾体母核及边链的选择性降解机理具有生理活性甾体类药物的基本母核目前都是从高等动植物中获得的，首先必须有选择性地对其边链进行降解。甾醇边链降解机理与脂肪酸的β氧化途径相似。胆甾醇的边链降解从C27羟基化开始，再氧化成C27羧醇，继后β氧化先失去丙酸、醋酸，最后再失去丙酸，形成C17酮化合物，最后一步转化为脱氢，加水和开裂。甾体母核的降解，先在C3进行酯化，3β-羟基氧化后接着Δ5双键被异构酶催化转位为Δ4双键，但此步异构化也可发生于非酶催化。在3-酮-4-烯化合物9α-羟基化后，随着C-1(2)-脱氢同时，甾体母核A环芳香化并导致β环开裂。第三节甾体激素的生产工艺过程甾体的微生物转化和一般的氨基酸、抗生素的生产不同，发酵的产物不是目的产物，而只是利用微生物的酶对甾体底物的某一部位进行特定的化学反应来获得一定的产物。整个生产过程，微生物的生长和甾体的转化完全可以分开，一般先进行菌的培养，在菌生长过程中累积甾体转化所需要的酶，然后利用这些酶来改造分子的某一部位。甾体的微生物转化生产流程甾体的微生物转化两个阶段。生长阶段，它是将菌种接入斜面培养基或小米培养基培养3~5d，然后将成熟的菌种细胞或孢子接入摇瓶或种子罐，给予合适的温度、溶氧浓度、pH值等条件培养，使其充分繁殖与生长。转化阶段是在微生物生长的终点，逐渐将甾体的粉末或适当的（有机）溶液加到培养物中，或把成熟细胞分离洗涤，然后悬浮于水或缓冲液中，再将底物加入，加入方式如图。大多数甾体化合物难溶于水，所以常用的方法是先把底物溶于有机溶剂，如丙酮、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺，浓度在2%对微生物无毒性。或用表面活性剂（如吐温80）来提高基质溶解度。甾体氧化需要较大的通气量，一般为1：0.8（v/v/min）。甾体加入的速度随菌种转化能力和基质的性质而定，采用基质的定期加入和连续加入的办法来解决基质或产物的毒性问题。转化后的产物大多不溶于水，所以采用溶媒萃取法进行提取。微生物转化生产甾体化合物一般采用二级培养，其工艺流程如下。如果产物分泌在发酵液中，则发酵滤液采用离子交换树脂吸附法吸附甾体化合物，洗脱后，减压浓缩进行结晶。甾体微生物转化方式进行微生物转化反应可以利用不同形式的微生物细胞。菌体培养物（单菌体或混合菌体培养液）静止细胞悬液（使菌体充分生长发育后，用过滤或离心法进行分离，将收集到的菌体悬浮在水或适当的缓冲液中，再将甾类化合物加入进去。）孢子悬液干细胞固定化细胞或固定化酶等。氢化可的松的制备氢化可的松（Hydrocortisone）又称为皮质醇，化学名称为11β，17α，21-三羟基孕甾-4-烯-1，20-二酮。其结构式为氢化可的松为白色或几乎白色的结晶性粉末，无臭，初无味，随后有持续的苦味，遇光逐渐变质，略溶于乙醇或丙酮，微溶于氯仿，在乙醚中几乎不溶，不溶于水。熔点为212~222℃。氢化可的松为皮质激素类药物，具有影响糖代谢、抗炎、抗毒、抗休克及抗过敏等作用。主要用于肾上腺皮质功能不足和自体免疫性疾病。应用于某些感染的综合治疗。消化性溃疡病、骨质疏松症、精神病、重症高血压患者忌用，充血性心力衰竭、糖尿病、急性感染病慎用。反应原理在产物中，除了氢化可的松（简称β体）（b）外，还产生11α-羟基化合物即表氢可的松（又称为α体）（c）、少量的其它位置的羟基化合物和未转化的化合物S（a）。所以在产品的分离纯化时，以上各种物质必须分离出去。第四节其他工艺技术及技术改造方向工艺过程开发新产品红霉素的半合衍生物：罗红霉素、阿齐霉素、克拉霉素和地红霉素等。这类半合成红霉素具有耐酸、高效、长效等特点，可减少给药剂量和次数，所以不良反应发生率亦比红霉素低。将红霉素制备成红霉素有机酸盐类和酯类衍生物可大大地改进了红霉素的性能。如红霉素乳糖酸盐用为注射剂，可用于口服红霉素不能耐受的病人或为控制严重感染而需产生高血浓度红霉素时应用。红霉素硬脂酸盐，对酸稳定，可口服，味微苦，胆汁中浓度较高。丙酰基红霉素十二烷基硫酸盐俗称无味红霉素，口服后胃肠道吸收快，且不受食物影响，血浓度出现慢，但高而持久，其高峰血浓度比硬脂酸盐高。