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纳米金颗粒AuNps06012325荣旭1959年美国诺贝尔奖获得者查理·费曼在美国加州理工学院召开的美国物理年会上预言:“如果人们能够在原子/分子的尺度上来加工材料,制造装置,将会有许多激动人心的新发现,人们将会打开一个崭新的世界。”这在当时只是一个美好的梦想。现在这个梦想正在一步一步的实现之中。何为纳米金？•纳米金即指金的微小颗粒，其直径在1～100nm，具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性。由氯金酸通过还原法可以方便地制备各种不同粒径的纳米金，其颜色依直径大小而呈红色至紫色。常态下的纳米金溶液显示出宝石红色纳米金的制备•制备纳米金，主要还是采用还原剂，如柠檬酸钠、硼氢化钠等，还原氯金酸。氯金酸在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金纳米颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称为胶体金。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金制备方法配制浓度为2.44×10-3mol/L的HAuCl4·4H2O溶液、浓度为3.43×10-2mol/L的Na3C6H5O7·2H2O溶液、浓度为1.00×10-4mol/L的PVP溶液,以及浓度为0.391mol/L的NaBH4溶液备用。在烧杯中加入10mL氯金酸溶液,10mL或不加保护剂溶液,80mL三蒸水,将烧杯置于数显测速恒温磁力搅拌器上,边加热边搅拌,搅拌的转速设置为600r/min,加热至75℃,恒温2min,用移液管移取一定体积的还原剂(Na3C6H5O7或NaBH4)溶液,迅速一次加入到上述混合液,开始计时,使液体颜色恒定并持续加热一段时间共9min,停止加热,继续搅拌5min后,停止搅拌,冷却至室温,所得液体为纳米金溶胶。发展历史•16世纪欧洲现代化学的奠基人、杰出的医师、化学家Paracelsus制备出“饮用金”用来治疗精神类疾病•1857年英国科学家法拉第在研究道尔顿的理论时，利用氯化金还原出含纳米金的溶液，发现在其中加入少量电解质后，可使溶液由红宝石色变为蓝色，并最终凝集为无色，而加入明胶等大分子物质便可阻止这种变化。•1885年纳米金溶液在美国常作为治疗酗酒的主要成分；•l890年Koch医生发现结核杆菌不能够在金的表面存活，同时纳米金被用来治疗关节炎；•1935年芝加哥外科专家Edward等人发现纳米金溶液能有效的减轻患者病痛，强健体质。•1939年Kausche和Ruska用电子显微镜观察金颗粒标记的烟草花叶病毒，呈高电子密度细颗粒状。•1971年Faulk和Taylor首次采用免疫金染色(immunogoldstaining，IGS)将兔抗沙门氏菌抗血清与纳米金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门氏菌的表面抗原，开创了纳米金免疫标记技术。应用现代四大标记技术之一的纳米金标记技术(nanogoldlabellingtechique)实质上是蛋白质等高分子被吸附到纳米金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是纳米金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合，而且吸附后不会使生物分子变性，由于金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。由于球形的纳米金粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白等非共价结合，因而在基础研究和实验中成为非常有用的工具。1．1作为显微镜示踪物•1978年，Geobegan等将纳米金标记抗体用于普通光镜下检测B淋巴细脑表面膜免疫球蛋白，建立了光镜水平的免疫金染色(immunogoldstaining，IGS)。1981年Danscher用银显影方法增强金颗粒的可见度，并提高了灵敏度。Holgate等人于1983年建立了用银显影液光镜下金颗粒的可见性的免疫金银染色法(immunogold-siliverstaining，IGSS)，利用银的增强作用，加大单独金粒子在光镜下可视粒子的半径，增加了小颗粒金粒子的标记密度，提高了灵敏度。1986年Fritz等人又在IGSS法基础上成功地进行了彩色IGSS法，使得结果更加鲜艳夺目。尽管如此，由于亚硝酸银化合物是光敏性的，需要在暗室里进行标记，实验操作非常的不便，改用非光敏的醋酸银化合物，价格又过于昂贵，所以纳米金在光镜中的应用日渐减少。而利用纳米金的高电子密度，能在电镜下清晰的分辨颗粒，作为在透射电镜(TEM)、扫描电镜(sEM)和荧光显微镜的示踪物在电镜免疫化学和组织化学中得到了广泛应用。1．2应用于均相溶胶颗粒免疫测定技术•均相溶胶颗粒免疫测定法(solparticleimmunoassay，SPIA)是利用免疫学反应时金颗粒凝聚导致颜色减退的原理，将纳米金与抗体结合，建立微量凝集试验检测相应的抗原，如间接血凝一样，用肉眼可直接观察到凝集颗粒。已成功地应用于PCG的检测，直接应用分光光度计进行定量分析。l.3应用于流式细胞仪•应用荧光素标记的抗体，通过流式细胞仪(FlowCytoMeter，FCM)计数分析细胞表面抗原，是免疫学研究中的重要技术之一。但由于不同荧光素的光谱相互重叠，区分不同的标记很困难。Boehmer等研究发现，纳米金可以明显改变红色激光的散射角，利用纳米金标记的羊抗鼠Ig抗体应用于流式细胞术，分析不同类型细胞的表面抗原，结果纳米金标记的细胞在波长632nm时，90度散射角可放大10倍以上，同时不影响细胞活性。而且与荧光素共同标记，彼此互不干扰。因此，纳米金可作为多参数细胞分析和分选的有效标记物，分析各类细胞表面标志和细胞内含物。纳米金技术在食品安全快速检测中的应用•目前食品检测分析一般采用化学分析法(CA)、薄层层析法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)，但需要繁琐、耗时的前处理，样品损失也较大。相对于灵敏度较低的CA和TLC方法，GC、HPLC的灵敏度较高，但操作技术要求高、仪器昂贵，并不适合现场快速测定和普及，而以纳米金为免疫标记物的检测技术正弥补了这些技术的缺点，在现代食品分析检测中的运用也越来越多。2．1兽药残留•所谓兽药残留是指动物产品的任何可食部分所含兽药的母体化合物及，或其代谢物，以及与兽药有关的杂质的残留。兽药残留既包括原药也包括药物在动物体内的代谢产物。主要的残留兽药有抗生素类、磺胺药类、呋喃药类、抗球虫药、激素药类和驱虫药类。兽药通常是通过在预防和治疗动物疾病用药、在饲料添加剂中使用以及在食品保鲜中引入药物而带来对食品的污染。人长期摄入含兽药的动物性食品后，不但会对人体产生毒性作用，出现过敏反应，而且动物体内的耐药菌株可传播给人体，当人体发生疾病时，就给临床上感染性疾病的治疗带来一定的困难，延误正常的治疗。另外有些残留物还具有致畸、致癌、致突变作用。•Verheijen利用胶体金标记纯化的抗链霉素单克隆抗体，对链霉素的检测限为160ng/ml，检测方便快速，不需要其他试剂和仪器，时间仅需lOmintl41。而使用胶体金免疫层析试纸条，在检测虾肉等组织试样中残留氯霉素(chloramphenicol，CAP)残留时，灵敏度可达到lng/ml，只需5～10min，并且与类似物没有交叉反应。YongJin等也使用金标法来检测动物血浆和牛奶中的新霉素残留，其检测限为10ng/mltl6J。盐酸克伦特罗即β2受体兴奋剂，俗称“瘦肉精”能增强脂解和减慢蛋白质分解代谢，若在畜牧生产中使用，可明显提高饲料转化率和瘦肉率；但使用剂量过大，则会对动物和人(间接)的肝脏、肾脏等器官产生严重的毒副作用。尽管欧盟于1996年禁止在畜牧生产中使用该药(ECDirec．tive96/22/EC)，我国农业部也于1997年明令禁止，但国内“瘦肉精”中毒事件时有发生。刘见使用金标试纸法快速检测检测盐酸克伦特罗，最小检测量达到40ng/ml。现在商品化的试纸条产品现在也比较成熟，比利时UCBBio-products公司开发的TlheBetaSTAR检测法就是将特定的β-内酰胺受体固定在试纸条上，用胶体金有色微粒作为标记物，5min内可以检测到青霉素和头孢霉素残留。而国内的刘平在用生物电化学传感器检测牛奶中残留的青霉素时，认为使用纳米金将有助于提高传感器的检测限。2.2动物传染病•动物传染病不但会影响动物养殖经济，也对人类健康构成威胁，联合国粮农组织和世界卫生组织已把预防和控制严重的动物流行病作为其工作重点之一。虾白斑病毒(whitespotsyndromevirus，WSSV)是阻碍虾养殖业发展的主要因素，至今还没有有效的药物，所以及早检测出病毒，显得尤其重要。WangXiaojie等已成功研究了斑点免疫金渗滤法(DIGFA)t19~和金标试纸法来检测虾白斑病毒，其中金标试纸法的检测限为1μg/ml，而使用银增强，可以达到0．0lμg/ml。赖清金等使用金标试纸条来检测猪瘟病毒，10～15min就能检出结果，并可根据检测结果合理指导猪瘟免疫和建立适宜的免疫程序。禽流感病毒(AIV)是引起禽类急性死亡的烈性、病毒性传染病，而且能感染人，我国许多地区也先后报道有高致病性禽流感的发生，给养禽业造成了重大的经济损失，也严重威胁了人类的健康。刘永德等将兔抗禽流感H5、H9亚型病毒抗体纯化后，分别与制备的胶体金研制成免疫金探针，用改良的渗滤法安全快速地检测被检材料中禽流感H5、H9亚型病毒，3min即可得到结果，检测灵敏度分别为1．62ug/ml和1．25μg/ml。2.3农药残留•农药残留分析的困难包括：样品基质背景复杂、前处理过程繁琐，需要耗费较多的时间、被测成分浓度较低、分析仪器的定性能力受到限制、仪器检测灵敏度不够等一系列问题，但使用金标记的快速检测可以很好的解决以上问题。国内的王朔分别使用纳米金免疫层析和纳米金渗滤法检测西维因的残留，整个检测过程只需5min，检测限也分别达到100ug/L和50μg/L。国内的生物技术公司也开发出了成熟的商品化产品，如克百威农残速测试纸条等。小结•随着科学技术的不断发展，食品分析检测技术也在不断地更新、完善和迅速发展，尤其是快速检测技术更能适应现代高效、快速的节奏和满足社会的要求。仪器分析法可以保证数据的精确性和准确性，但其流程仍比较烦琐。尽管以纳米金为标记物的免疫分析法及其它速测技术的开发过程需投入较多资金和较长时间，但具有简单、快速、灵敏度高、特异性强、价廉、样品所需量少等优点，其灵敏度与常规的仪器分析一致，适合现场筛选，而且其中的金免疫层析技术正在向定量、半定量检测和多元检测的方向发展，更加体现出金标技术的优势。总之，快速检测技术的快速、灵敏、简便等优点，使之在食品卫生检疫和环境检测中有着广泛的应用价值和发展前景。•制备方法