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第二章:基因工程工具酶主讲教师:杨应斌答疑QQ号:715656164基因工程一、DNA限制性内切酶二、甲基化酶三、分子克隆过程中所需要的另一些酶Lurva和Human（1952）以及Bertani和Weigle（1953）发现了噬菌体λ的限制作用各种细菌都能合成一种或几种顺序专一的核酸内切酶。这些酶切割DNA的双链，因为它们的功能就是切割DNA，限制外源性DNA存在于自身细胞内，所以称这种核酸内切酶为限制酶。合成限制酶的细胞自身的DNA可以不受这种酶的作用，因为细胞还合成了一种修饰酶，它改变了限制酶识别的DNA顺序的结构，使限制酶不能起作用。目前，从各种生物中分离出的限制性内切酶已接近200种，其中80多种是切割DNA双链。（一）命名原则限制性内切酶主要是从原核生物中提取的。现在通用的命名原则是：属名种名株名如果同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……来代表。Haemophilusinflueuzaed酶名HindIIIEscherichiacoliRY13EcoRⅠ（二）分类和特性第二类限制性内切酶的识别顺序是一个回文顺序,如EcoRI的识别顺序为：5’……G*A-A-T-T-C……3’3’……C-T-T-A-A*G……5’讨论:下面的序列中可能含有多少个潜在的酶切位点?GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGA132654一、DNA限制性内切酶二、甲基化酶三、分子克隆过程中所需要的另一些酶二、甲基化酶限制-修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶（methylase）来完成的。甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序。甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基化，保护DNA不被限制性内切酶切开。DNA甲基化酶普遍存在于原核和真核生物中，能将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到腺嘌呤或者是胞嘧啶上。在原核生物中，DNA甲基化酶作为限制修饰系统的一个组成部分广泛存在，它们的作用是保护宿主菌不被相应的限制性内切酶切割。大多数实验室使用的大肠杆菌包括三种位点特异性的DNA甲基化酶。由dam基因（Dam甲基化酶）编码的甲基化酶能将甲基转移到GATC序列中的腺嘌呤N6位点上。由dcm基因编码的Dcm甲基化酶，能在CCAGG和CCTGG序列内部的胞嘧啶C5位置上甲基化。EcoKI甲基化酶，可将AAC（N6A）GTGC和GCAC（N6A）GTT上的腺嘌呤进行甲基化修饰。(1)原核生物ＤＮＡ甲基化如果限制性内切酶的识别位点是从表达Dam或Dcm甲基化酶的菌株中分离而得，并且其甲基化识别位点与内切酶识别位点有重叠，那么该限制性内切酶的部分或全部酶切位点有可能不被切割。例如，从dam+E.coli中分离的质粒DNA完全不能被识别序列为GATC的MboI所切割。E.coli菌株中的DNA甲基化程度并不完全相同。pBR322DNA能被完全修饰（因此完全不能被MboI切割），而λDNA只有大约50%的Dam位点被甲基化，这是因为在λDNA被包装到噬菌体头部之前，甲基化酶还没来得及将DNA完全甲基化。因此，被Dam或Dcm甲基化完全阻断的酶却能对这些λDNA进行部分切割。被Dam或Dcm甲基化的限制性位点可以通过克隆DNA至dam-/dcm-菌株【如dam-/dcm-E.coli感受态细胞（NEB#C2925）】进行去甲基化。(1)真核生物ＤＮＡ甲基化在高等真核生物（如Dnmt1）中发现的CpG甲基转移酶（CpGMTases），将甲基基团转移至胞嘧啶残基上的C5位点。CpG甲基化形式受遗传因素的影响，具有组织特异性，并与基因表达相关。因此，我们推测CpG甲基化在基因分化和表达中起了一定的作用。在消化真核基因组DNA时尤其要关注CpG甲基化的影响。需要注意的是，一旦DNA被克隆到宿主菌中，将不存在CpG甲基化形式。一、DNA限制性内切酶二、甲基化酶三、分子克隆过程中所需要的另一些酶（一）DNA聚合酶（二）RNA聚合酶（三）反转录酶（四）核酸外切酶（五）核酸酶S1（六）DNA酶（七）RNA酶（八）连接酶（九）末端转移酶（十）碱性磷酸酶（一）DNA聚合酶（DNapolymerase）的作用是将1个脱氧三磷酸核苷酸加到引物（primer）的3’-OH上，释放出一个焦磷酸分子（ppi)聚合酶主要有以下两种种：1．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ2．噬菌体DNA聚合酶1．大肠杆菌DNA聚合酶（E.ColiDNApolymerase）主要有3种作用：①5’→3’的聚合作用。但不是复制染色体而是修补DNA，填补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。②3’→5’的外切酶活性。消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。③5’→3’外切酶活性。切除受损伤的DNA。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是完整的DNA聚合酶Ⅰ的一个片段，只有在5’→3聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，失去了5’→3外切酶活性。2．噬菌体DNA聚合酶这里以T4DNA聚合酶为例。它也具有5’→3聚合酶活性，但它的外切酶活性比大肠杆菌的要高200倍。因此，它也可用来补齐单链末端或标记同位素。催化转录的RNA聚合酶是一种由多个蛋白亚基组成的复合酶。（二）RNA聚合酶真核生物的RNA聚合酶真核生物的RNA聚合酶分三类：RNA聚合酶Ⅰ存在于核仁中，转录rRNA顺序。RNA聚合酶Ⅱ存在于核质中，转录大多数基因，需要“TATA”框。RNA聚合酶Ⅲ存在于核质中，转录很少几种基因如tRNA基因如5SrRNA基因。（三）反转录酶反转录酶（Reversetranscripatase）是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。（四）核酸外切酶大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（exonucleaseⅢ）是从带3’-OH末端的双链DNA，按3’→5’方向切除5’单核苷酸：（八）连接酶（十）碱性磷酸酶本章结束!